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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒的验证
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)

[求助] 重组质粒的验证 已有2人参与

各位大侠，本人最近做一个克隆，转化后挑取单克隆，LB摇菌后，进行菌液PCR，引物为我克隆基因的上下游引物，结果显示，有两个克隆出现目的大小条带，而且亮度很大（远远高于marker中最亮的条带），于是信心满满地提取质粒进行酶切验证，结果，电泳显示无任何条带，将质粒上样后也五条带，怀疑是试剂盒的问题后，换一种试剂盒提取，提取物上样电泳显示，没有质粒。这是为什么呢？请赐教，谢谢！
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1楼 2015-10-24 02:19:51
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q120465872

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by wuyuanqing at 2015-10-24 20:06:44
谢谢你的建议，我这是连续做了五个克隆后第六个出现这个问题，一直想不通，看来以后需要这样设计引物了。另外请教一下，如果是残留，为何会在抗性培养基里生长却没有质粒？
...

这个问题很复杂了，可能是杂菌，也可能是其他未知原因。
分子实验如果一直顺利，有一个重要的方法或者说实验原则一直被我们忽视了，但是一旦出问题，就必须拿出来用了。那就是做对照，可能出问题的每一步都做对照。千万不要着急哦，静下心来仔细梳理一遍自己的实验流程，想想可能出问题的地方，甚至休息一天半天的再重做，试剂有疑问的也重配。
另外不知道你是什么载体、条带大小？
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赐予我力量，去改变我所能改变的；赐予我勇气，去接受我所不能改变的；并赐予我智慧，去分辨这两者。
12楼2015-10-24 20:31:24
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
http://www.dxy.cn/bbs/thread/31813222#31813222
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wuyuanqing
3楼2015-10-24 12:22:08
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tolobio

新虫 (小有名气)
商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
引用回帖:
4楼: Originally posted by wxb2061 at 2015-10-24 14:03:02
都给你们做了，又怎样来锻炼
...

有道理。建议等锻炼好之后，如果同意质粒构建是重复、机械劳动的话，可以联系我们。
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5楼2015-10-24 14:12:29
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ssswzf

金虫 (小有名气)
提取的质粒是不是这样子的啊？下图都是质粒的提取图片
我也感觉很奇怪，换其他的质粒都可以，就这个这么调皮
TOP10 提取puc质粒，碱裂解
重组质粒的验证
20151023.jpg
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6楼2015-10-24 17:19:38
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