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[求助]
环状RNA相关问题！
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1.环状RNA的引物设计及所用软件； 2. 环状RNA的siRNA设计； 3. 环状RNA过表达载体构建 |
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执着的狼
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【答案】应助回帖
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酣睡未起: 金币+10, 博学EPI+1 2015-10-18 20:54:55
酣睡未起: 金币+10, 博学EPI+1 2015-10-18 20:54:55
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吉赛生物研发了两款含双酶切位点的环状RNA过表达载体，直接通过酶切连接插入目的环状RNA片段，并保证插入的环状RNA目的片段在细胞内正确环化和高效表达。pcD-ciR表达框架中间插入KpnI和BamHI酶切位点，慢病毒表达载体pLO-ciR表达框架中间插入EcoRI和NdeI酶切位点，可以满足瞬时表达和稳定表达不同需求。 构建流程: 1、环状RNA线性序列PCR扩增 2、直接连接到过表达载体 3、细胞内RNA剪接形成环状 4、特异性准确表达 |
3楼2015-10-18 15:08:42
feiben的蜗牛
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2楼2015-10-18 12:21:29
执着的狼
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酣睡未起: 金币+20 2015-10-18 20:55:04
酣睡未起: 金币+20 2015-10-18 20:55:04
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这篇文章是研究环状RNA的，相关的方法你可以参考一下，希望对你有所帮助。引物设计软件的话用primer 5.0应该是可以的。 siRNA设计大都根据Tuschl的实验，要点如下： 1.目标基因开放阅读框起始密码下游75至100碱基位置开始，寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列。（用非“AA”的“XY”序列后的19个碱基序列同样可以得到很好效果的siRNA）。 设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区。 2.分析获得的序列，选择GC比在40-55%之间的靶基因序列作为优选。 3.将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。 4.如果选择shRNA，有报道显示9个寡核苷酸的环是最有效的。 下面是另一个设计的版本，大致相同： 1. 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。 2. 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST 3. 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 负对照 一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。 如果计划合成siRNA，那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列，厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT结尾，如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。 现在Qiagen公司的网站上有完整的siRNA 的设计方法，可以自动设计并生成多个备选序列，并且可以自动连接到基因组数据库进行检索比对。 |
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2015-10-18 15:10:23, 14.03 M
4楼2015-10-18 15:16:29
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5楼2015-10-18 15:20:50
