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tian150685新虫 (小有名气)
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Gibson Assembly已有1人参与
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| 我的实验需要使用Gibson Assembly将线性化的载体和扩增后的目的片段进行连接，我如果将载体进行XhoⅠ单酶切 ，那扩增后目的片段设计引物的时候需要加上XhoⅠ酶切位点吗？ |
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3楼2015-10-09 21:04:14
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2015-10-09 21:26:38
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2015-10-09 21:26:38
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Gibson Assembly 方法是 Daniel Gibson发明的将多个DNA 片段在1 次反应中实现分子间连接. 此方法关键要求是连接片段与线性化载体首尾有一小段的互补重叠序列. 采用Gibson Assembly 方法仅需要对载体进行单酶切线性化，利用互补DNA 序列可实现多 段DNA 序列的无缝连接，不需要依赖特定的酶切位点。 1. 设计包含片段间20-25 bp 互补重叠序列的引物，通过PCＲ 扩增出带有首尾重叠的目的DNA 片段。（在合成引物时在特异引物的末端加上载体线性化位点两侧的序列，而不需要分析目的片段的限制性内切酶酶切位点等信息。）  2. 对载体进行单酶切线性化。（本方法只需对载体进行一种限制性内切酶酶切，获得线性化载体，而插入片段不需要进行酶切产生相同的黏性末端。） 3. 利用T5 核酸外切酶(T5 exonuclease)的5'→3'外切酶活性产生黏性末端，带有互补的重序列DNA 配对。 4. 利用Phusion DNA polymerase补齐片段上的缺口部分。 5. 最后通过Taq DNA Ligase将多个DNA 片段连接起来。  Gibson Assembly连接体系为10 μL: 载体3 μL，克隆片段1 μL，混合酶6 μL，50 ℃反应20 min。 参考资料： 1. Gibson assembly https://en.m.wikipedia.org/wiki/Gibson_assembly 2. 应用Gibson Assembly 方法构建植物表达载体 |
2楼2015-10-09 21:02:35
15623507725
新虫 (初入文坛)
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4楼2018-03-19 15:41:05