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1012203014金虫 (正式写手)
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[求助]
二硫键（游离巯基）含量用DTNB测定 稀释倍数计算方法 已有1人参与
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测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。 巯基含量的计算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值 D—稀释倍数 C—样品浓度（mg/mL） 问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量更好的方法  |
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2楼2018-03-13 16:20:59
chenwei1227
金虫 (小有名气)
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- 专业: 环境微生物学
【答案】应助回帖
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问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 答：是的，你的方法里面没有做稀释，因此是1，有的protocol上是吸取上清0.1 mL加入到0.9 mL Tris-Gly 缓冲液中进行测定，这时稀释倍数就是10. 问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性 答：主要取决于你采用的缓冲液能否完全溶解样品，可以参考测得350μmol/g这个浓度的提取方法进行角蛋白的溶解。 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量更好的方法 答：参阅文献，目前除了Ellman试剂方法外还有荧光检测的方法，但还是取决于能否完全溶解你的毛发样品。 |
3楼2019-06-03 12:58:05
