| 查看: 2485 | 回复: 36 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
关于酶切的一点经验
|
|||
|
酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水。 不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer（常识）。NEB和promega的酶都不错的，我们常用的酶是NEB（new england biolabs）公司生产的酶。使用前应该阅读NEB公司的产品目录和该酶的使用说明。下面分几个方面简要说明： 1，DNA，自己制备的DNA，样品中不应该有酚，氯仿，酒精，EDTA，盐离子等的污染，这些东西会影响酶的活性。这个问题应该在提质粒阶段避免。 2，酶，酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的1/10。（因为酶是储存在50％甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过5％就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置）。如果切点位于线状质粒两端，酶切效率将会大大降低。 3，buffer，不同的酶配有不同的buffer，产品目录和酶的使用说明中会说明该酶用哪种buffer，有些buffer中需要另外添加BSA，不要忽略了哦。 4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切。 5，反应条件，大多数酶都是37度半小时以上。 6，电泳检测。条带不清楚跟电泳也有关系。首先是胶的浓度，不同浓度的胶适合分离不同大小的片段，这个你看看分子克隆之类的书，一般来说，1％的gel可以用于500bp－6，7kb的片段分离。其次是电压，电压不能太高。这些你肯定都很清楚，我就不赘述了。还有如果载体很大，而切下来的片段很小，那么切下来的片段就会因为质量小而不容易看清楚，比如从10kb的载体上切下来200bp的片段这种情况，解决方法就是多切一些，再点marker仔细看。 7，双酶切。因为不同的酶需要不同的buffer，所以有两种情况：1）两种酶是同样的buffer。尽量用同一个公司的酶，这样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种酶，注意事项是体积和酶量。2）两种酶是不同的buffer，先用一种buffer离子浓度底的酶切，电泳检测，单酶切开以后，将产物抽提，沉淀，加入离子浓度高的buffer再酶切。http://www.neb-china.com/cn/tech/re/double_digests.htm网站也有建议。 这个网站也可仔细看看啊，总之熟能生巧，实验肯定是越做越好的。 BEST WISHES |
回复此楼» 猜你喜欢
求调剂，一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕
已经有4人回复
-
考研调剂
已经有9人回复
-
304材料求调剂
已经有4人回复
-
一志愿郑大085600，310分求调剂
已经有3人回复
-
317求调剂
已经有7人回复
-
复试调剂，一志愿南农083200食品科学与工程
已经有4人回复
-
一志愿太原理工安全工程300分，求调剂
已经有3人回复
-
284求调剂
已经有11人回复
-
食品工程专硕求调剂
已经有3人回复
-
324求调剂
已经有7人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
qiyaocheng
木虫 (小有名气)
老虫
- BioEPI: 1
- 应助: 19 (小学生)
- 金币: 3070.1
- 帖子: 269
- 在线: 103.2小时
- 虫号: 349942
- 注册: 2007-04-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
14楼2008-10-16 11:08:25
2楼2008-09-03 07:49:25
3楼2008-09-03 17:17:27
shuijing415
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 717.4
- 散金: 44
- 帖子: 143
- 在线: 67.6小时
- 虫号: 522780
- 注册: 2008-03-11
- 专业: 食品加工技术
4楼2008-09-08 21:01:14
