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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白质技术专题开版
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hittyman

铜虫 (小有名气)

指没有生物学活性

胱氨酸－半胱氨酸（3.6mM半胱氨酸，0.36mM胱氨酸）在选择别的比例，谷胱苷肽氧化型和还原型的效果要比其他体系好一些，但是比较贵，我作的中试工艺，以后可能是要工厂化生产，另外梯度洗涤复性时选择6M尿素－1M尿素，流速1/100v(柱体积），在室温复性，室温20多度，没有4度大层析柜，复性时间是过夜。blueGuy版主是不是建议加长复性时间，我会试试，另外你对复性液组成有什么看法
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31楼2005-06-07 08:42:49
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BlueGuy

荣誉版主 (正式写手)

懒懒的小虫虫
在做中试工艺了，说明小试已经没有什么问题了。要是没做小试，建议先以一升菌做小试。小试需要的谷光甘肽的量就很少了，现在谷光甘肽也不是很贵，60-120元/g。过夜复性的时间已经差不多够了。另外，你复性完了之后有可溶蛋白么，如果有，那可能是蛋白没有后修饰而造成的没有活性。你复性后，蛋白的复性率有多少？
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32楼2005-06-07 15:30:13
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hittyman

铜虫 (小有名气)

包涵体蛋白复性

由于是在公司干，小试是另外一个博士做的，据说复性效率有10％左右，根据他的方法，我没有重复出来，现在郁闷中。不过还是要做下去，现在每个步骤都要重复去除问题，不同浓度的氧化还原体系正在尝试。
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33楼2005-06-07 16:09:06
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BlueGuy

荣誉版主 (正式写手)

懒懒的小虫虫
10%的复性率已经不低了！怎么能重复不出来，我觉得还是有问题！他复性后有活性么？
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34楼2005-06-07 16:16:01
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hittyman

铜虫 (小有名气)

如何解决后修饰

我在稀释复性重复实验过程中，两步复性基本得到可溶蛋白，不溶的很少，而且被过滤除去。如何解决后修饰问题。
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35楼2005-06-07 16:17:37
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hittyman

铜虫 (小有名气)

蛋白复性

由于离的比较远，他在北京，平时只能电话联系，上次我就问他，说是有活性，而且经过抑菌实验检测有明显抑菌效果，但是我作了就是没有活性，我也想他能有10
％活性回收率，那我的再怎么地也能有1％－3％，一点活性也没有。测活方法和他的一样
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36楼2005-06-07 16:23:24
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hittyman

铜虫 (小有名气)

blueGuy版主

后修饰主要指的是什么，需要注意什么问题。
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37楼2005-06-07 16:29:58
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BlueGuy

荣誉版主 (正式写手)

懒懒的小虫虫
后修饰有很多，比如蛋白的剪接、糖基化、磷酸化、乙酰基化等等。
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38楼2005-06-07 16:35:47
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BlueGuy

荣誉版主 (正式写手)

懒懒的小虫虫
大肠杆菌表达的蛋白没有后修饰加工作用。你可以参照他的方法，完全重复一下，如果能重复，说明没问题，否则只能自己摸条件了！
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39楼2005-06-07 16:39:28
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hittyman

铜虫 (小有名气)

大肠杆菌表达的蛋白

我的蛋白就是在pGEX6T中表达，那就是说没有后加工修饰的作用，但是没有修饰就不会有活性。也不是所有的蛋白都需要修饰才有活性，对不对
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40楼2005-06-07 17:03:08
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