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jimmyt铁杆木虫 (正式写手)
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[交流]
求助sephadex LH20的用法
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本人小菜鸟一个，看文献我的工作好像需要用到sephadexLH20柱层析，对此没什么概念，希望各位做过此类工作的高手给发个比较详细的操作流程啊，最好包括使用哪些化合物啊，最主要的是操作流程，比如凝胶粉处理啊，装柱啊，收集跟踪分析啊，如果文件比较大可以发到我的邮箱：jimmy_cun@yahoo.cn。小弟拿出家当的一半20个金币作为报酬，小小敬意。希望各位高手指教。 [search]sephadexLH20[/search] |
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3楼2008-09-02 09:31:59
鸭绿江畔
铁杆木虫 (著名写手)
牛B
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这个东西你先看看 凝胶色谱技术 凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 （一）分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。 （二）色谱柱的重要参数 ⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。 ⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。 ⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。 ⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve 表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。 二、凝胶的种类及性质 （一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex） ⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。 ⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。 （二）琼脂糖凝胶： 商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。 （三）聚丙烯酰胺凝胶： 是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。 （四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。 三、实验技术 （一） 层析柱 层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外， 直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。 分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。 （二）凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量为20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。 （三）凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。 （四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。 分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。 （五）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有: ⑴叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。 ⑵可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。 ⑶乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。 ⑷苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。 如果是自制的凝胶色谱柱，用大量水冲洗，洗完了在水中浸泡即可，下次用时活化一下（水煮一小时） 如果是现成的柱子，用水保存就行了或用甲醇和水保存 请教如果样品做多了峰型变得不好，峰宽变大，怎样处理 国产葡聚糖凝胶使用说明 金欧亚®凝胶色谱法原理：是利用被分离物质分子量大小、形状的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离（分子筛原理），大分子物质由于扩散受阻，在凝胶中行径较短而最先洗脱下来，进入凝胶内的小分子物质按分子大小由大至小被洗脱下来，从而达到相互分离的目的，根据样品的性质选用水、缓冲溶液加盐或有机溶剂作为流动相。 1、在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，抽滤，用无盐水洗去残存的乙醇；在无盐水中充分溶胀24小时。 2、将溶胀后的凝胶脱气后（真空或超声波）根据装柱要求一次性均匀置入柱内，注意保证湿态装柱，并避免柱内产生气泡和断层。 3、上样前缓冲溶液平衡层析柱至少二--三个柱体积直到记录仪基线变的平稳为止（流出液的pH值等于Buffer的pH值）。 4、凝胶过滤的上样量一般为5-7%的床体积，我们建议初次上样量控制在1-2%的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关，难分物质要有一定柱高和流速控制 |
2楼2008-09-02 08:35:05
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Sephadex LH20层析柱的用法 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要*凝胶过滤作用来分离。 Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇-水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿-甲醇最为常见，先用50％氯仿-甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。 如果样品极性大，请选用反相溶剂洗脱（甲醇-水），样品用最少体积的甲醇-水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要过滤！如果堵住了Sephadex LH20，就得将Sephadex LH20的柱头部分弃去，很可惜）。如果样品极性小，就选用正相溶剂洗脱（氯仿-甲醇），样品用最少体积的氯仿-甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 我的分离技巧有：（1） 流速不可太快，切切不可性急，所谓欲速则不达。（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20柱长的增加将极大地改善分离，不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。要集中优势兵力，打击敌人。（3）馏分一定要接的细，可1/10，或1/20 个保留体积接成一馏分。（4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质。（6）Sephadex LH20对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。 Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的（任何填料都是这样，只是Sephadex LH20更明显），一般在丙酮，乙酸乙酯中收缩很厉害，所以一般不用丙酮，乙酸乙酯作溶剂，如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨程度相差很大，还会产生大量气泡。以下列举了1g干态的，Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积： water 2.1ml MeOH 1.9ml EtOH 1.8ml CHCl3 1.6ml n-BuOH 1.6ml 丙酮 0.8ml 乙酸乙酯 0.4ml 甲苯 0.2ml 样品的溶解最好与洗脱的起始浓度相同，但多数情况下都办不到。对Sephadex LH20上样样品的要求是1、样品一定要溶解（Sephadex LH20很贵，要保护填料；同时，避免样品不溶解造成的脱尾）。2、溶解样品的体积尽可能小（色谱分离理论的基本要求，减小原始谱带宽度）3、样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同（若样品的溶解溶剂比洗脱的起使浓度洗脱能力强，则会人为增加洗脱起使溶剂的洗脱能力；同时若样品的溶解溶剂与洗脱的起使溶剂差别很大，样品可能以为溶解性的问题而析出）。以上三点是上样的基本要求，有时很难求全，只有根据具体的实际来决定了。一般我的做法是满足1，2点，尽量满足第三点，“如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇-水），样品用最少体积的甲醇-水（尽可能甲醇少一些）溶解”，请注意我的陈述是“尽可能”。 在分离过程中如果要分离的样品量很大，而柱层填料相对较少的情况是很多的。一般解决的途径有两条：1）将样品一次全上柱，这样分离效果一定不会好，但我们的侧略是将样品交叠的部分再上一遍或几遍，这叫反复xxxx柱层，好处是工作量小（对比下面就知道了），在前后较纯的馏分，如果目标组分量足够，效果就更好。2 ）将样品分几次分别分离，这样每次分离的效果一定比将样品一次全上柱的分离效果好，但这样有一个很大的弊病，就是每次柱层的条件不可能保持完全一致，这样几次柱层分离的馏分间的重现性就存在很大问题，再将几个分开上的柱层馏分合并的过程中，合的太粗，就如同将样品一次全上柱的合并结果，只是工作量增大了。如果心中不甘，你中有我我中有你的馏分，我也不知怎么合并了。所以推荐的做法是将样品一次全上柱，再通过反复柱层的方法来逐步提高分离效果。一般Sephadex LH20上样体积具体也没有明确的规定，大约为柱床体积的1/10。 样品经过分离一般而言会产生两种结果：1、目标组分的相对纯度提高，因为经过分离后各组份分别在不同的馏分富集，当然在富集目标组分的馏分中目标组分的含量要比总样中的含量要高，所以我们说目标组分得以纯化。2、目标组分的绝对量减少，因为无论是什么分离手段，物质的分离总会有交*，意即不但目标组分分布于主要富集目标组分的馏分中，相邻馏分中也定会有它的踪影，只是可能不是相邻馏分的主成分，从分离的角度，那些相邻馏分并非是我们想要的，我们只将目标组分的相对含量高的馏分用于下一步分离，这种结果必然是与原样相比用于下一步分离的馏分中目标组分的绝对量要少一些。 实验中如何蒸干甲醇水呢？像水这种高沸点的溶剂是比较难蒸干的，但办法是有的。我们可以先看看旋转薄膜的几个要素：真空度， 冷凝液， 蒸发温度。1） 真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性。一般的国产水泵就能满足日常的需要（包括蒸水），但一定注意的是水泵的循环水一定要开，如果不开循环水，水泵中的水很快就会变得很热，将极大地减少水泵的效率，且会将抽出的溶剂挥散出来，很不好! 比国产水泵更好的是进口水泵，比进口水泵更好的是隔膜泵，系统的密闭性就更重要了，特别是蒸像水，丁醇这样的溶剂，对系统的密闭性的要求很高，对于系统密闭性不好时，可采用逐步拆分法来查漏，最容易出问题的地方在垫圈，国产的旋转薄膜配的垫圈很烂，全不耐氯仿等有机溶剂，当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂，垫圈就废了。所以要多预备几个垫圈。2） 冷凝液一般使用水，如果配一台冷阱，使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液， 效果很好。3） 提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率，但可能发生物质的变化，国产旋转薄膜，水泵，用水冷，当然就只好提高蒸发温度了。 如果Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤， 将柱头堵住，或由于样品的死吸附（一般很少发生），使柱子的柱头部分污染，一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去，具体做法很简单，只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起，倒掉即可。如果柱子整个被污染，如果是将Sephadex LH20用反相被污染，办法如下：依次用水，NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分），所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。 经验之谈，与大家一起分享。 |
4楼2008-09-02 10:12:09
nanbowang3
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5楼2008-12-17 21:26:27
