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沙海林空

木虫 (正式写手)

[求助] 关于质粒提取遇到的问题 已有5人参与

我想用大肠杆菌来进行质粒的抽提,但我首先需要让质粒在大肠杆菌体内产生,
请问通常是用什么办法把原先的质粒导入到细菌体内?
生物小白,希望各位高手帮忙
谢谢
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Die-Luft-der-Freiheit-weht.
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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沙海林空: 金币+5 2015-09-16 19:25:33
利用大肠杆菌感受态细胞,可以将质粒导入到其中,一般常用DH5α感受态,导入方法常用的有,电转,和化转,在网上应该可以搜到
2楼2015-09-16 10:12:32
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ASWDR

金虫 (小有名气)

比较简单的可以用钙离子溶液处理,制备感受态细胞,再转质粒进去

发自小木虫Android客户端
3楼2015-09-16 10:17:35
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syhzlsd

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
沙海林空: 金币+5 2015-09-16 19:25:21
用感受态细胞直接转化质粒就可以了!
4楼2015-09-16 10:44:15
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chenllili

铜虫 (正式写手)

去一个做基因工程方面的实验室看一下就好了,这都是很成熟的实验流程了。你自己摸索的话,纯属耗时间。

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5楼2015-09-16 12:41:19
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learningying

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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沙海林空: 金币+10, 有帮助 2015-09-16 19:24:56
那么多金币都不给我们发放啊。流程:提取质粒——转化(热激法转化,或者电穿孔法)——涂布平板,挑选克笼子——验证——大量摇菌——提取质粒——其他实验用。
加油,天道酬勤
6楼2015-09-16 15:59:28
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沙海林空

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by learningying at 2015-09-16 15:59:28
那么多金币都不给我们发放啊。流程:提取质粒——转化(热激法转化,或者电穿孔法)——涂布平板,挑选克笼子——验证——大量摇菌——提取质粒——其他实验用。

谢谢,我了解了一下,只需要直接将质粒加入到细菌培养液中就行。
Die-Luft-der-Freiheit-weht.
7楼2015-09-16 19:24:58
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learningying

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 沙海林空 at 2015-09-16 19:24:58
谢谢,我了解了一下,只需要直接将质粒加入到细菌培养液中就行。...

是这样子,但是要注意那个菌液是感受态细胞,不然你转化不出来的。。。

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加油,天道酬勤
8楼2015-09-16 20:30:08
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兰兰园丁

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
沙海林空: 金币+15, ★★★很有帮助, 多谢 2015-09-17 19:19:11
引用回帖:
7楼: Originally posted by 沙海林空 at 2015-09-16 19:24:58
谢谢,我了解了一下,只需要直接将质粒加入到细菌培养液中就行。...

你说的这个是最常用用热激吧,这也不是单单的把质粒加到大肠杆菌里。是这样的,细胞先经处理成细胞壁松散的状态,即感受态细胞,加入质粒混匀后冰浴20分,质粒沉降到细胞表面,42度热激1分钟,细胞通透性增大,质粒进入细胞内,再冰浴2分钟,质粒就出不来啦!就进入细胞内,松弛型质粒的话就可以拷贝出多份啦!也还有其他很多方法可以导入质粒。

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9楼2015-09-17 00:36:19
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蘑菇头1

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

热激转化感受态细胞,将质粒(20ng以上)加入感受态,冰上静置30min,42℃热激90s,冰上静置3~5min,超净台上加入1mL的液体LB,摇菌1~1.5h后离心1min,弃上清,留约100微升的液体,用枪吸打使之悬浮混匀,后涂布到加有相应抗生素的固体LB板上,37℃先正放0.5h,后翻板倒放8~12h即可
10楼2015-09-19 11:22:03
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