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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

[交流] PCR的目的片段是2200bp左右,但是扩增不出来 已有6人参与

PCR的目的片段是2200bp左右,但是扩增不出来,出来的条带在600bp左右,我用的酶是transstart KD plus dna polymerase,模板是逆转录后的cDNA
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neon_alone

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
如果模板是CDNA的话,模板质量好坏很重要,还有就是引物设计很重要。PCR扩不出来原因太多了,只能逐渐摸索,你说的太过广泛,不好分析。你首先要确定你的CDNA 260/280在1.8-2才比较好,而且比较新不会降解的问题。而且比如50ul体系中,模板就100-300ng比较好,多了也不行。引物特别特别重要,退火我一般从53-58设置梯度除非比较特殊的情况。另外我推荐一个全式金的酶,fastPFUfly,加入硫酸镁的,你可以试试。适用于复杂的模板
3楼2015-09-13 16:38:04
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naringenin

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
光pcr出不来的可能性就有很多,何况是反转录pcr,你提供的信息不足以判断任何事情。
anyway,根据我多年反转录pcr的经验,
大部分反转录pcr做不出来的原因在于RNA质量差。
当然还有很多其他可能的原因。
只能祝你实验顺利了。
2楼2015-09-13 16:01:12
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liutong1026

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
实验每一步都需要验证的,不要等最后了出不了结果在去找愿因。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2015-09-14 13:23:38
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biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚:专业/专注/专心


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
高品质2×逆转录MIX,操作方便简单,RT反应只需加入模板和水,免费试用申请进行中,有意请PM哦······
年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折!交流锤炼知识,用心构筑桥梁,以更优质的产品及技术服务助力科研;QQ:2513165427;Email:b
5楼2016-04-25 17:16:35
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