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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 关于NTA-Ni纯化带有Flag标签的融合蛋白
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shxteacher

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 关于NTA-Ni纯化带有Flag标签的融合蛋白

本人今天实验发现一个奇怪的现象：
我讲带有Flag标签的融合蛋白的细胞裂解液过NTA-Ni的重力柱，然后用1xBinding buffer洗柱子（15倍柱体积），然后直接用1xStrip buffer（主要成分是EDTA溶液），并且收集1xStrip buffer的洗脱液（1倍柱体积），然后跑SDS-PAGE，发现存在一个比较纯的而且是带有Flag标签的目的蛋白。
说明：目的蛋白仅带有Flag标签，不带有His标签。

我很疑惑：难道Flag标签的融合蛋白也可以吸附在NTA-Ni重力柱？
Flag tag的蛋白序列：DYKDDDDK
His tag的蛋白质序列：HHHHHH

我在怀疑是不是Flag标签中含有较多的天冬氨酸，也可以螯合Ni？
不知道有木有科研同仁遇到这样的情况？
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OMG
1楼 2015-09-12 22:20:40
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穿白大褂约会

禁言 (小有名气)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-14 23:07:12
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5楼2015-09-14 22:32:11
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lxzk

木虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-14 23:06:27
你的蛋白本身有没有类似序列？Ni柱的特异性不是很强，经常会从裂解液中拉下一些条带。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-09-13 09:51:39
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naringenin

新虫 (小有名气)
★
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flag里面的天冬氨酸是带正电的，我想如果ni柱恢复的不好的话，有些空位点连上了flag标签，而后strip buffer洗下来了吧？
话说为啥不用咪唑洗蛋白呢
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3楼2015-09-13 15:49:27
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-09-14 23:06:49
存在很多疑点：
1.上样量多少，是否过量。
2.你依据什么判断的不带HIS标签？？？？你用还有EDTA的溶液洗脱，镍离子被EDTA结合，从柱子上洗脱下，同时，HIS标签也会被洗脱下来。
3.要判断，你先用咪唑试试，用EDTA 洗脱，说不含有HIS标签有点草率，你用EDTA洗镍柱，你的镍柱那能用么？？你要再生重新挂捏么。
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4楼2015-09-14 09:35:45
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