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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 大肠杆菌做透射电镜怎么制样？
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jianghe888

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by smilingworld at 2015-08-18 14:33:23
透射电镜？transmission electron microscope （TEM）的标本么？楼主要观察菌的什么？

观察菌的形态。请问拍照前怎么制样？
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11楼2015-08-18 15:58:23
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smilingworld

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
jianghe888: 金币+8 2015-08-19 10:22:27
引用回帖:
11楼: Originally posted by jianghe888 at 2015-08-18 15:58:23
观察菌的形态。请问拍照前怎么制样？...

大概制作过程：1. 从固体培养基上挑取10余个左右的单一菌落，放入到5ml PBS中，不要混入培养基成分。2. 混匀细菌液（PBS中），离心大概在3000 rpm， 10到15分钟左右（PBS就是清洗军体表面的培养及成分）。3. 去除PBS上清，加入2% glutaraldehyde－PBS 混合液（1～2ml）固定，低温保存（4度）2小时。4. 离心混合液，3000 rpm x 10 min，再加入5 ml PBS， 清洗， 离心。5. 加入1～2% OsO4（1～2 ml）再固定，振荡混匀， 低温保存（4度）2小时。6. 离心，去除上清夜，然后用glutaraldehyde－PBS 混合液清洗，离心，去上清 （glutaraldehyde 和 OsO4都是有害物质，需要存放在特殊的位置）。7. 准备2%的寒天，可溶解在PBS中，大概在寒天45度的时候用巴斯德pipet包埋细菌标本，然后放在载玻片上，待寒天彻底变成固体，用道边切成四方小体型（这一步过程中，寒天的温度不可过烫，否则烫坏菌体，不可过凉，否则混入细菌时不能包埋均匀）。8. 脱水，将寒天菌体四方小块，放入到50%，70％，90%，95%，100%的酒精中脱水，每一过程30 min。9. 重复100％酒精脱水2次，30 min。10. 准备树脂混合物，Epon：DDSA：MNA＝2:1:1， 混合均匀，加入2%的DMP－30，再混合均匀（2%是相对于树脂混合物来说，最后颜色大概为为橘红色）。11. 用制备完全的树脂混合物，1:1混合propylenoxide（树脂混合物要准备双份，既要最后埋入标本还要做此混合物），然后将固定，脱水好的标本浸入此混合物，存放过夜（overnight）。12. 将标本浸入到树脂混合物中。用小勺或者针头挑取浸入步骤11混合物过夜的标本，放入树脂混合物中。此过程中，树脂混合物应该放入到小的capsule中，白色塑料的，然后标本会慢慢沉入到树脂混合物的最底部，假如悬浮在树脂中，说明脱水过程不够完全。然后将沉入树脂底部的标本（capsule）放入到60度保温箱中，存放24小时以上，待树脂完全变硬，用特殊的仪器切此标本，我们研究室用的是一种准们的钻石刀。当然要先把变硬的标本用普通的刀片修整好，用钻石刀切之前，capsule尖头部的标本形态应该是梯形。为了区别标本，可以在树脂变硬前，用一个很小的纸注明标本的名称，然后放入树脂中，这样就可以知道标本是什么了，正好被固定在标本内，用铅笔。

希望我表述清楚了，也希望对你有用
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12楼2015-08-18 18:05:04
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
jianghe888: 金币+4, 谢谢！ 2015-08-24 10:31:19
离心=>戊二醛预固定=>悬球加戊二醛固定过夜=>锇酸固定=>梯度脱水=>二氧化碳临界点干燥=>浸透包埋聚合=>造模切超薄片=>醋酸铅负染=>直接载物或预处理=>TEM观察
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13楼2015-08-19 15:40:03
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匿名
本帖仅楼主可见
14楼2015-08-19 16:01:49
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huzhang01
祝福。。。
15楼2015-08-19 16:28:27
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守望88

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
？？？怎么这样的？求教
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加油！
16楼2016-11-30 13:54:13
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