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jianghe888

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by smilingworld at 2015-08-18 14:33:23
透射电镜?transmission electron microscope (TEM)的标本么?楼主要观察菌的什么?

观察菌的形态。请问拍照前怎么制样?
11楼2015-08-18 15:58:23
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smilingworld

新虫 (小有名气)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
jianghe888: 金币+8 2015-08-19 10:22:27
引用回帖:
11楼: Originally posted by jianghe888 at 2015-08-18 15:58:23
观察菌的形态。请问拍照前怎么制样?...

大概制作过程:1. 从固体培养基上挑取10余个左右的单一菌落,放入到5ml PBS中,不要混入培养基成分。2. 混匀细菌液(PBS中),离心大概在3000 rpm, 10到15分钟左右(PBS就是清洗军体表面的培养及成分)。3. 去除PBS上清,加入2% glutaraldehyde-PBS 混合液(1~2ml)固定,低温保存(4度)2小时。4. 离心混合液,3000 rpm x 10 min,再加入5 ml PBS, 清洗, 离心。5. 加入1~2% OsO4(1~2 ml)再固定,振荡混匀, 低温保存(4度)2小时。6. 离心,去除上清夜,然后用glutaraldehyde-PBS 混合液清洗,离心,去上清 (glutaraldehyde 和 OsO4都是有害物质,需要存放在特殊的位置)。7. 准备2%的寒天,可溶解在PBS中,大概在寒天45度的时候用巴斯德pipet包埋细菌标本,然后放在载玻片上,待寒天彻底变成固体,用道边切成四方小体型(这一步过程中,寒天的温度不可过烫,否则烫坏菌体,不可过凉,否则混入细菌时不能包埋均匀)。8. 脱水,将寒天菌体四方小块,放入到50%,70%,90%,95%,100%的酒精中脱水,每一过程30 min。9. 重复100%酒精脱水2次,30 min。10. 准备树脂混合物,Epon:DDSA:MNA=2:1:1, 混合均匀,加入2%的DMP-30,再混合均匀(2%是相对于树脂混合物来说,最后颜色大概为为橘红色)。11. 用制备完全的树脂混合物,1:1混合propylenoxide(树脂混合物要准备双份,既要最后埋入标本还要做此混合物),然后将固定,脱水好的标本浸入此混合物,存放过夜(overnight)。12. 将标本浸入到树脂混合物中。用小勺或者针头挑取浸入步骤11混合物过夜的标本,放入树脂混合物中。此过程中,树脂混合物应该放入到小的capsule中,白色塑料的,然后标本会慢慢沉入到树脂混合物的最底部,假如悬浮在树脂中,说明脱水过程不够完全。然后将沉入树脂底部的标本(capsule)放入到60度保温箱中,存放24小时以上,待树脂完全变硬,用特殊的仪器切此标本,我们研究室用的是一种准们的钻石刀。当然要先把变硬的标本用普通的刀片修整好,用钻石刀切之前,capsule尖头部的标本形态应该是梯形。为了区别标本,可以在树脂变硬前,用一个很小的纸注明标本的名称,然后放入树脂中,这样就可以知道标本是什么了,正好被固定在标本内,用铅笔。

希望我表述清楚了,也希望对你有用
12楼2015-08-18 18:05:04
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
jianghe888: 金币+4, 谢谢! 2015-08-24 10:31:19
离心=>戊二醛预固定=>悬球加戊二醛固定过夜=>锇酸固定=>梯度脱水=>二氧化碳临界点干燥=>浸透包埋聚合=>造模切超薄片=>醋酸铅负染=>直接载物或预处理=>TEM观察
13楼2015-08-19 15:40:03
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z
14楼2015-08-19 16:01:49
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祝福。。。
15楼2015-08-19 16:28:27
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守望88

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
???怎么这样的?求教
加油!
16楼2016-11-30 13:54:13
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