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codico

银虫 (小有名气)

[求助] 真菌的绝对定量荧光pcr如何做标准曲线 已有2人参与

刚开始接触荧光PCR，请教大家一个问题：
我的目的是绝对定量样本中的DNA的提取量，首先要做标准曲线，但是标准品如何制作呢？是自己提取核酸，然后通过浓度以及核酸溶液体积计算核酸总重量，然后通过单个基因组的重量算出拷贝数，然后做十倍梯度？但是提取的核酸中除了基因组DNA， 还有大量的线粒体DNA(真菌为真核生物)以及RNA，这个计算一定相当不准确吧。还是说这种标准品是可以购买的？通过什么渠道可以购买到某一特定的菌某一个基因的标准品呢？
谢谢大家！
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1楼 2015-08-16 11:08:54
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

绝对定量的control不是你这样搞的
标准品是一个浓度，或者自定义单位已知的东西（比如滴度，要知道待测品和标准品之间的关系）。
比如，已知序列/分子量，质量的某一段体外转录RNA；已知序列/分子量，质量的某一段质粒，这些RNA/质粒上带有你引物可以扩增的片段或者直接带有你PCR得到的全部片段，
对于你这种直接测基因组DNA的待测品，就没必要整RNA了，直接用质粒DNA，或者纯化的PCR产物，定量后就行。
用这个做标准曲线，在Ct和绝对浓度之间得到标准曲线，可以计算你的检测样品浓度。
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3楼2015-09-15 19:25:19
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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

反转录为cDNA，根据公式计算出拷贝数后，10倍倍比稀释制作标曲
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2楼2015-09-15 17:06:08
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cf沐晴

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-15 19:25:19
绝对定量的control不是你这样搞的
标准品是一个浓度，或者自定义单位已知的东西（比如滴度，要知道待测品和标准品之间的关系）。
比如，已知序列/分子量，质量的某一段体外转录RNA；已知序列/分子量，质量的某一段 ...

那测转录组得到的序列，做荧光定量要用绝对定量还是相对定量？

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4楼2017-10-06 18:48:32
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