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细胞转染的原理及步骤已有3人参与
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转染 ，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ① 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ② 震荡后将试剂放在-20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例(1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。 三、第二次细胞传代 1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。 |
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A. 细胞接种: 1.转染前24小时左右对细胞进行转接，接种密度约为每孔0.3~1×105个细胞； 2.过夜培养。 B. DeofectEU /DNA复合物包装(该步完成后应立即转染): 1.在1.5 ml无菌离心管中加入50μl无血清培养基，并添加适量的转染试剂(2~5μl/μg DNA，参见下表) 。用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。 2.在1.5 ml无菌离心管中加入50μl无血清培养基，并添加适量的DNA (0.8~1μgDNA/孔， 参见附表)。用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。 3.将DeofectEU-培养基混合物滴加至DNA-培养基混合物中，用移液器轻轻混匀后在室温静置15~20分钟后，立即转染。注意： DeofectEU-培养基混合物和DNA-培养基混合物的混合次序非常重要，切勿颠倒。 C.转染: 注意：DeofectEU 在完全培养基中(基础培养基中添加血清)具有最高的转染效率，因此转染前后不需要换成无血清培养基。 1.如特殊情况，可在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基，以防转染后孵育阶段细胞密度太大、营养不足导致的细胞死亡。 2.将步骤B制备的复合物滴加至培养基中。轻轻晃动培养皿以使复合物均匀分布。 3.过夜培养24~48小时。 |
4楼2019-03-06 09:08:42