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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR标准品无明显扩增！
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wildhui

新虫 (著名写手)

[求助] 荧光定量PCR标准品无明显扩增！ 已有2人参与

最近用Takara的一步法荧光定量TaqMan试剂盒（RR064A）检测病毒，扩增病毒的引物的灵敏性和特异性及探针是别的实验室验证过的，引物和探针是英俊新和成的。可是不但标本无扩增，连标准曲线都扩增不明显，标准品用的是体外转录的RNA，浓度1408ng/ul，通过公式计算出拷贝数后，10倍倍比稀释，从10的12次方稀释到10的0次方，然后分别取10的7次方到10的0次方的8个浓度及10的10次方到10的3次方的8个浓度，体系是20ul体系，反应条件为stage1：（reps1 ）42℃ 15min，95℃ 10s，stage2：（reps40）95℃ 10s，60℃ 34s.扩增了好几次，结果都类似。本人为新会员，没有金币给大家，请各位大侠帮我分析原因，万分感谢！！万分感谢！！图片如下：

荧光定量PCR标准品无明显扩增！
标准品1


荧光定量PCR标准品无明显扩增！-1
标准品1（浓度从10的10次方到10的3次方）


荧光定量PCR标准品无明显扩增！-2
标准品1


荧光定量PCR标准品无明显扩增！-3
标准品2


荧光定量PCR标准品无明显扩增！-4
标准品2（浓度从10的7次方到10的0次方）


荧光定量PCR标准品无明显扩增！-5
标准品2
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用心每一天，不忘初心，方能走远！
1楼 2015-07-23 11:10:02
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wildhui

新虫 (著名写手)
怎么没有回复啊！以上问题已经困扰我1个月了，现在怀疑试剂盒的问题，有大侠用过takara的荧光定量TaqMan试剂盒么？这个试剂盒怎么样啊？说明书上程序设定逆转录时间只有5min，我延长到15min，可是结果无明显改善！该怎么办呀！
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用心每一天，不忘初心，方能走远！
2楼2015-07-24 09:05:05
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wildhui

新虫 (著名写手)
求大家帮帮我！十分感谢啦！
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用心每一天，不忘初心，方能走远！
3楼2015-07-24 15:07:53
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pqq226

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也是刚用的Takara的一步法试剂盒，扩增曲线倒是有，但是作出来的标准曲线斜率和相关系数没有参考意义，我觉得是不是操作有什么问题
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开心最重要
4楼2015-08-17 10:09:56
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

从图可以看出你的PCR是没有扩增，假如takara试剂盒是没有问题的：
1）你是否为PCR实验新手，在做实验的时候会忘了这个，那个。
2）如果排除自己的因素，可能的问题就是你的引物探针是否能够工作，还有takara所推荐的PCR扩增条件是否适用于你的引物探针。
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5楼2015-08-17 12:02:32
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