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再闹不给糖新虫 (正式写手)
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RT-PCR引物设计求助 已有2人参与
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我设计过两次RT-PCR引物，第一次用的是primer premier 5.0 设计的引物，用的软件自带的搜索引物功能，然后参照Tm，GC含量（选取45%-60%之间Tm值相近的作为引物）以及还有dimer hairpin，false priming，选取自认为最优组合，然后发给公司合成回来之后，先用easy taq 酶体系跑普通pcr，凝胶检测结果条带比较暗，然后又用RT-PCR检测了一次，无数据出现，电泳检测，也没有目的条带出现 第二次设计RT-PCR是用NCBI网站来设计的，直接在上面输入CDS序列，搜索引物，然后按照上面搜过结果，选取成对的引物，Tm值在60+-3 大都很相近 ,然后引物自身的dimer（NTI检测，约2~5个），偶尔有发夹结构存在， 直接送公司合成回来后，直接用的RT-PCR检测，也无条带出现 已确定cDNA无问题，RT-PCR试剂盒为 快精（英文名字好像是QIjin还是什么的，公司当初取名快精还被笑称过猪饲料） 引物长度为20~22左右，经过NCBI与目的材料全基因组比对之后，除了目的染色体上面引物全部匹配外，还有其他染色体约7~8个，是14~16个碱基连续匹配的，我有一个疑问，就是按照这个匹配度来说，RT-PCR是不是至少会有带出现，不会出现无数据的情况吧、？ 还有一个就是RT-PCR引物设计问题，小白一个，初次接触这个，真心不懂，设计了两次之后，都没效果，不知道该咋办了，真心求助！！！ |
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