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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » RT-PCR引物设计求助
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR引物设计求助已有2人参与

我设计过两次RT-PCR引物，第一次用的是primer premier 5.0 设计的引物，用的软件自带的搜索引物功能，然后参照Tm，GC含量（选取45%-60%之间Tm值相近的作为引物）以及还有dimer  hairpin，false priming，选取自认为最优组合，然后发给公司合成回来之后，先用easy taq 酶体系跑普通pcr，凝胶检测结果条带比较暗，然后又用RT-PCR检测了一次，无数据出现，电泳检测，也没有目的条带出现

第二次设计RT-PCR是用NCBI网站来设计的，直接在上面输入CDS序列，搜索引物，然后按照上面搜过结果，选取成对的引物，Tm值在60+-3 大都很相近   ,然后引物自身的dimer（NTI检测，约2~5个），偶尔有发夹结构存在， 直接送公司合成回来后，直接用的RT-PCR检测，也无条带出现

已确定cDNA无问题，RT-PCR试剂盒为  快精（英文名字好像是QIjin还是什么的，公司当初取名快精还被笑称过猪饲料）

引物长度为20~22左右，经过NCBI与目的材料全基因组比对之后，除了目的染色体上面引物全部匹配外，还有其他染色体约7~8个，是14~16个碱基连续匹配的，我有一个疑问，就是按照这个匹配度来说，RT-PCR是不是至少会有带出现，不会出现无数据的情况吧、？

还有一个就是RT-PCR引物设计问题，小白一个，初次接触这个，真心不懂，设计了两次之后，都没效果，不知道该咋办了，真心求助！！！
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
1楼2015-07-19 22:41:52
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Kellyyoung

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你们都自己设计引物吗？为什么我们都是找出序列，让公司合成
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4楼2015-07-28 15:20:55
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JNVBNC

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-21 23:04:48
你分析过目的片段吗？是不是GC含量太高了呀？比如80%以上
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2楼2015-07-21 22:45:10
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by JNVBNC at 2015-07-21 22:45:10
你分析过目的片段吗？是不是GC含量太高了呀？比如80%以上

GC含量还好，没那么高，初次判断可能还是引物有问题，一次性设计了六对引物，一个都没有条带，反向引物可能有点问题，等这次反向引物回来了，验证一下就知道什么情况了，谢谢你哈
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
3楼2015-07-22 14:25:57
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Kellyyoung at 2015-07-28 15:20:55
你们都自己设计引物吗？为什么我们都是找出序列，让公司合成

自己设计引物，然后送公司合成
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
5楼2015-07-28 17:18:36
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