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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 乳酸菌同源重组基因敲除PCR验证求救
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ankey呦

新虫 (初入文坛)

[求助] 乳酸菌同源重组基因敲除PCR验证求救已有2人参与

本人做乳酸菌基因敲除，采用同源重组方法，敲除目的基因的同时引入抗性基因，筛选到了一株疑似突变菌，但在pcr验证基因组时，总是既出现突变后的条带3400bp，也有正常菌的条带2800bp，即使纯化四代了提取基因组也一样，而正常菌只有2800，有高手前辈明白原因么？是菌还是不纯？还是菌能够自己修复回原来的基因？急求前辈指点啊！谢谢！
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敲除验证

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1楼2015-07-19 12:31:53
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panlook

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

也有可能是插到其他地方去了，如果是这样的话  也许会p到2条条带
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5楼2015-08-06 15:08:20
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红塔山和云烟

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ankey呦(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-19 20:06:25
楼主应当将PCR鉴定引物设置在你的目的基因外，如果鉴定引物是与你的目的基因互搭的话就会出现楼主上述的情况（即扩增出重组后的条带，也有原始长度的条带），希望能帮助到你
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2楼2015-07-19 14:47:26
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ankey呦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 红塔山和云烟 at 2015-07-19 14:47:26
楼主应当将PCR鉴定引物设置在你的目的基因外，如果鉴定引物是与你的目的基因互搭的话就会出现楼主上述的情况（即扩增出重组后的条带，也有原始长度的条带），希望能帮助到你

非常感谢您的帮助，目前我的引物就是设计在同源臂外侧的基因组上的，如果未突变应该不会有3400的条带啊，只是不明白为什么每次挑取单菌落培养后的菌PCR既有突变的3400又有正常菌的2800？能指点下吗？谢谢！
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3楼2015-07-19 16:44:50
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红塔山和云烟

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
ankey呦: 金币+4, ★有帮助, 非常感谢您的建议 2015-07-20 09:15:16
引用回帖:
3楼: Originally posted by ankey呦 at 2015-07-19 16:44:50
非常感谢您的帮助，目前我的引物就是设计在同源臂外侧的基因组上的，如果未突变应该不会有3400的条带啊，只是不明白为什么每次挑取单菌落培养后的菌PCR既有突变的3400又有正常菌的2800？能指点下吗？谢谢！...

这种情况在大肠杆菌里也遇到过，楼主可以试试回收3400的片段 然后送去测序一下 如果测序结果表明突变成功应该就没有问题 也有可能没挑到单菌落.

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4楼2015-07-19 20:33:40
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