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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

[求助] pcr扩增后 电泳后条带不对 请大侠帮忙! 已有3人参与

下面是我的电泳图   红框里是我的问题条带 基因原长是2900BP左右
PCR模板 是连了T载体的质粒
酶切是可以获得目的基因的 就是 红框后面的酶切条带
但是pCR得不到目的条带
我重新提取了野生型的DNA 也没有扩增出目的条带
我用的酶有primier start  普通TAQ也没有。。。
求解!!!!!!!!!!!!!!1

pcr扩增后 电泳后条带不对 请大侠帮忙!
2015.6.11 sdp37 sdp27 hmg pcr2.jpg


pcr扩增后 电泳后条带不对 请大侠帮忙!-1
2015.6.11 sdp37 sdp27 hmg pcr2.jpg
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-07-10 21:06:29
你说的问题条带是什么意思?是你的目的条带吗?2900bp也不算长啊,引物模板退火温度都是要考虑的,质粒作为模板扩增也很常见,应该不会有问题吧(你自己看看)引物也得你自己验证了,,可以使用hot start taq酶扩增试试看,改用热启动PCR的方法,高保真酶可能会让模板降解吧
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-07-10 10:11:44
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-07-10 10:11:44
你说的问题条带是什么意思?是你的目的条带吗?2900bp也不算长啊,引物模板退火温度都是要考虑的,质粒作为模板扩增也很常见,应该不会有问题吧(你自己看看)引物也得你自己验证了,,可以使用hot start taq酶扩增 ...

我的问题是我做了PCR 但是条带看上去不是质粒吗 就像质粒自己跑的电泳 没有经过PCR
3楼2015-07-10 10:52:45
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xianglixie3 at 2015-07-10 10:52:45
我的问题是我做了PCR 但是条带看上去不是质粒吗 就像质粒自己跑的电泳 没有经过PCR...

。。。什么 问题,我竟无言以对
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-07-10 10:54:44
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-07-10 10:54:44
。。。什么 问题,我竟无言以对...

就是 理论上来说我用红色框框框出来的带应该在 2900  但是事实上它不在
而且 这个带看上起很大 而且像是直接用质粒跑电泳  出现的条带
5楼2015-07-10 11:54:54
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hg30717580

木虫 (职业作家)

总经理

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-12 23:18:45
把你的模板质粒稀释下作为模板 再PCR扩增下试试看。
突破自我,喜迎曙光
6楼2015-07-10 16:22:27
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by xianglixie3 at 2015-07-10 11:54:54
就是 理论上来说我用红色框框框出来的带应该在 2900  但是事实上它不在
而且 这个带看上起很大 而且像是直接用质粒跑电泳  出现的条带...

楼主你想多了,那怎么可能是质粒直接跑的电泳,你设计引物是干嘛的,能跑出整个,那只是非特异性条带而已。。。。
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-07-10 17:00:24
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-12 23:19:03
楼主啊,问题我看了好久才看懂,下次上图的时候别把整张图都放上来。

据我分析,你质粒模板是加多了,引物还没经过三个循环就差不多用完了。仔细考虑下pcr前三个循环,相信你能懂的。
初来乍到,请多指教
8楼2015-07-10 23:11:05
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evil丶zero

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by ppppppppp at 2015-07-10 23:11:05
楼主啊,问题我看了好久才看懂,下次上图的时候别把整张图都放上来。

据我分析,你质粒模板是加多了,引物还没经过三个循环就差不多用完了。仔细考虑下pcr前三个循环,相信你能懂的。

你好,我刚刚进实验室,好多不懂,想问一下你,PCR前三个循环有哪些要注意的啊,我做PCR时就用genetool拖引物拿师兄给的体系跑,他们没有说这个问题。
9楼2015-07-12 16:27:11
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by hg30717580 at 2015-07-10 16:22:27
把你的模板质粒稀释下作为模板 再PCR扩增下试试看。

我稀释过 10 50 倍就没有带了
10楼2015-07-13 11:42:21
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