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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

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专业: 临床兽医学

[求助] 毕赤酵母菌落PCR筛选，这样到底是转化进去没？已有3人参与

我做的GS115，用Takara的Direct PCR裂解液裂解菌落，然后做菌落PCR，一端通用引物，一端特异性引物P不出来条带。
  然后我用两端特异性引物P，结果有的菌就P出目的条带了。
  最诡异的是我同时选了一个样做两端通用引物，P出了两条带，一条3K左右，一条淡淡的500bp，GS115本身有个条带就在3Kb附近，空载载体能P出500bp的条带，这样的话这个样就是空载咯？可是特异性引物P的时候，这个样是有目的条带的。

  在我看来，用两端通用引物；一端通用一端特异；两端都特异；三种方法只要P出目的条带，结果不都是一样的吗。不然目的条带哪里来的，就算引物不够特异，也不会刚好是目的条带的大小啊。我目的条带3kb，没那么容易假阳性吧。看文献很多人都写用通用引物鉴定，那如果是我这种情况，到底是转化了没？P不出条带又是什么原因呢？

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1楼 2015-07-08 16:37:49

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evil丶zero

金虫 (小有名气)

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专业: 微生物遗传育种学

引用回帖:

8楼: Originally posted by ggyy0911 at 2015-07-26 22:27:08
谢谢回答~~有种茅塞顿开的感觉。不过我觉得应该不会吧，因为我一个板子随机挑5个点PCR，结果没有随机性。有的样能出来，有的样就出不来。如果是你说的这种原因，应该怎么解决呢？如果每一个单克隆都划线分离的话太 ...

用两端通用引物PCR可不可能本身在单菌落上就能P出两组出来。换句话来说就是你设计通用引物时候确保了引物片段只有一段位点能互补么？
还有，一端通用引物一端特异性引物这种组合应该还有一种组合，5一瞥端用特异性或3一瞥用。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]