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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 我要扩一个基因的ORF框
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qaz139687

新虫 (小有名气)

[求助] 我要扩一个基因的ORF框 已有1人参与

上引物跟下引物设计有什么要求，上引物是不是就从ORF的起始密码子开始，还是可以稍微往前一点加点5-UTR区的碱基，下引物是不是就到终止密码子，还是可以到3-UTR区的碱基
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1楼 2015-06-12 14:40:06
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
qaz139687: 金币+3, ★有帮助 2015-06-16 19:44:44
探针，不是太熟悉，是要做southern blotting吗？如果是，个人觉得全段，或是p几百都可以，最好p全段，反正方法都是一样的，全段还可以防止以后其他实验会用到。。。
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4楼2015-06-15 12:59:06
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这要具体看你拿这段ORF干嘛了，如果只是想验证片段大小，引物就没啥要求，你说的两种都可以，如果你要是想将这段ORF扩到载体里，就要具体看你的载体是啥，插入到什么位置，用酶切链接还是self ligation还是什么，还要看你这段基因接下来还要做什么，做蛋白表达还是什么的，做表达是否要链接tag标签，是否要做荧光表达，还是什么，考虑的多了，设计的引物就不同
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2楼2015-06-12 15:12:58
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ksws0465326 at 2015-06-12 15:12:58
这要具体看你拿这段ORF干嘛了，如果只是想验证片段大小，引物就没啥要求，你说的两种都可以，如果你要是想将这段ORF扩到载体里，就要具体看你的载体是啥，插入到什么位置，用酶切链接还是self ligation还是什么，还 ...

扩到载体里面，合成探针用的，合成探针是不是一定要整个ORF，或者只是ORF框序列的一段几百bp大小就可以了
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3楼2015-06-14 13:43:01
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ksws0465326 at 2015-06-15 12:59:06
探针，不是太熟悉，是要做southern blotting吗？如果是，个人觉得全段，或是p几百都可以，最好p全段，反正方法都是一样的，全段还可以防止以后其他实验会用到。。。

不是，就是普通的原位杂交，看网上有些人说全长的话容易降解，不建议用全长，只要500bp以下的，不知道要在用哪部分片段，有么有什么要求
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5楼2015-06-16 11:39:05
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