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soyida

金虫 (初入文坛)

[求助] ATP荧光实验求助!!!已有2人参与

在下想用荧光显微镜和EMCCD结合Luciferin–luciferase的方法,观察细胞分泌ATP的荧光。
在一些文献中查到了同样的做法,但难点是查不到他们用的荧光素酶是哪里购买的。。。。
希望有知情的高手能够热心帮助,提供详细的购买方式,非常感谢!

另外补充一下,不是用化学发光仪或荧光光谱仪测量、或裂解细胞后测细胞内容物的,而是对活体细胞进行胞外检测。
若能提供购买方式,最好可以附上应用该试剂的文献。

再三顿首,不知所言。。
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用荧光显微镜和EMCCD结合Luciferin–luciferase的方法,观察细胞分泌ATP的荧光?
你要具体观察的对象是什么?荧光显微镜可以用于活细胞观测,我也有很多文献,但是你要告诉我你具体的实验目的。
2楼2015-06-03 10:08:48
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

不知道你的荧光分子标记的蛋白质或者其他分子有什么具体要求,一般而言,可以直接用有机荧光分子就行,另一个问题考虑细胞定位,当然是对活细胞进行荧光检测实验效果更好。
4楼2015-06-03 16:02:19
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普通回帖

soyida

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-03 10:08:48
用荧光显微镜和EMCCD结合Luciferin–luciferase的方法,观察细胞分泌ATP的荧光?
你要具体观察的对象是什么?荧光显微镜可以用于活细胞观测,我也有很多文献,但是你要告诉我你具体的实验目的。

加入荧光探针之后刺激细胞,可能用药理学或机械力刺激手段,这时细胞会分泌ATP
我就是想观察这个现象
3楼2015-06-03 14:28:47
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soyida

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-03 16:02:19
不知道你的荧光分子标记的蛋白质或者其他分子有什么具体要求,一般而言,可以直接用有机荧光分子就行,另一个问题考虑细胞定位,当然是对活细胞进行荧光检测实验效果更好。

我希望的效果就是:将荧光素酶加在胞外环境中,当细胞向外分泌ATP后,荧光素酶结合ATP并发荧光。
因为在文献中看到过这样的效果,所以觉得应该有成品探针出售吧。。
而有另外的文献中,是把探针锚定在细胞膜上,这样就只能标识出膜上的ATP,再向外扩散的就无法标识,另外就是使用起来比较复杂。
所以想请教下,有没有成品探针可以达到我的预期效果呢?
谢谢你的耐心回答。
5楼2015-06-03 16:35:14
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

你的意思是激活荧光素酶,使其发出荧光,这样不需要在进行额外的荧光标记,只需要检测荧光素酶的活性就行了。
6楼2015-06-04 08:42:45
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

我还是没有搞清出你检测的对象是不是细胞的分泌出的ATP,而荧光素酶仅仅是起到探针手段,还是荧光素酶本身也必须是被检测的对象?我希望搞清楚此事,以便我们继续讨论。
7楼2015-06-04 08:45:05
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

以上情况,无论哪一种,我可以同楼主具体在讨论,不过继续讨论前,我希望进一步明确论题。
8楼2015-06-04 09:03:02
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soyida

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-04 08:45:05
我还是没有搞清出你检测的对象是不是细胞的分泌出的ATP,而荧光素酶仅仅是起到探针手段,还是荧光素酶本身也必须是被检测的对象?我希望搞清楚此事,以便我们继续讨论。

检测对象是分泌的ATP,荧光素酶仅仅是探针,大概我没说清。。
9楼2015-06-04 09:41:27
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by soyida at 2015-06-04 09:41:27
检测对象是分泌的ATP,荧光素酶仅仅是探针,大概我没说清。。...

我这样就明白了,近几天我会给你一个参考用的试验流程。
10楼2015-06-04 11:13:44
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