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linglingys新虫 (小有名气)
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[交流]
酶切结果求解
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本人做双酶切 Fermentas Fast Digestion 63-1-B/ 63-1-H B：EcoRI/BamHI H: EcoRI/HindⅢ 63-1质粒浓度：1.5ug/ul water 15.3ul 10X FastDigest 2ul DNA(ug) 0.7ul FastDigest enzyme1 1ul FastDigest enzyme2 1ul Total volume 20ul 37℃ for 12hours 63-2-B/ 63-2-H B：EcoRI/BamHI H: EcoRI/HindⅢ 63-2质粒浓度：1.1ug/ul water 15ul 10X FastDigest 2ul DNA(ug) 1ul FastDigest enzyme1 1ul FastDigest enzyme2 1ul Total volume 20ul 37℃ for 12hours 原质粒：二次洗脱(取1ul+9ul无核酸水+1ul 10X Loading buffer)(质粒浓度63-1原:0.3ug/ul，63-2原:0.13ug/ul) Marker：DL5000 问题： B：EcoRI/BamHI 双酶切怎么又这么多片段，是酶切时间过长吗？另外EcoRI/HindⅢ 小片段应该是1500bp左右的，为什么实际看到是2000-3000bp之间呢？备注：质粒经测序鉴定转染成功的。  63-1.jpg |
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7楼2015-06-03 15:50:21
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-06-03 11:21:32
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-06-03 11:21:32
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切割时间太长了！明显给切花掉了~~至于切出带偏大 1.你的重组质粒大小正确吗？~确定是你的质粒无误~？ 2. 你63-1-H那个点样孔，最上面那条亮带是空载体的带吗？如果不是你载体的位置的话，你2000—3000的条带不一定是你双酶切出来的基因带，更像是Star活性切出来的带。LZ你的空载质粒多大？ 3.LZ你为什么要用快切酶37度12个小时处理呢？说明书上肯定不会这么写把，是因为以前尝试过短时间切割，切不出来带吗？我感觉你还是好好检查一下那个质粒是否是你筛出来的重组质粒~一般从载体上切基因很好切的，这几个内切酶也不太受甲基化的影响。如果切不开除非没有酶切位点或者你的酶切位点本身有问题。 |
3楼2015-06-03 01:25:58
阿Q~~
至尊木虫 (文坛精英)
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4楼2015-06-03 07:42:54