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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » Red敲除！求含sacB质粒和卡那抗性质粒
汕头大学海洋科学接受调剂
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日光海

铜虫 (小有名气)

[求助] Red敲除！求含sacB质粒和卡那抗性质粒 已有2人参与

如题，最近小弟做Red敲除，用上海大学一教授赠与的pEX18Ap扩sacB-bla打靶片段却怎么也P不出来，已经做了两个月了还是木有结果。结果用质粒转化DH5α后在15%蔗糖LB上都长出来了。。。怀疑质粒可能送错了。
所以想自己用overlap PCR将sacB和卡那霉素抗性片段连接到一起。但缺少sacB质粒。求含sacB的pEX18Tc、pEX18Gm、pEX18Ap或pCVD442中的任何一种，若有卡那抗性的质粒一并求助吧。目前实验室自己只有pRKaraRed和一些pMD18T等常规质粒，如需要可交换互助。
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周老湿
1楼 2015-05-26 15:35:11
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小小cool

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
日光海: 金币+40, ★★★★★最佳答案 2015-05-29 12:37:53
你好，我有这样的质粒，不能赠予，但可以交换，请联系q 2755157061
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2楼2015-05-26 16:32:03
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流水不争

铁杆木虫 (正式写手)

小木虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
日光海: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-05-29 12:38:07
可以直接从168中 扩增sacB基因呀
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3楼2015-05-28 21:40:27
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日光海

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 流水不争 at 2015-05-28 21:40:27
可以直接从168中 扩增sacB基因呀

我们实验室没有枯草168.而且枯草方向没什么研究。所以老板不会去买。我们实验室的枯草都是自己分离保存的。不过最近在武汉淼灵生物那找到了pK18mobSacB质粒。这个不错。
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周老湿
4楼2015-05-29 12:39:53
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日光海

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小cool at 2015-05-26 16:32:03
你好，我有这样的质粒，不能赠予，但可以交换，请联系q 2755157061

已经向你们公司购买了。发现你们公司质粒还是蛮多的，常用的和一些很少见的质粒都很齐全，而且很便宜。不过，最关键的还是要看是否能出结果啊。要是用你们质粒真做成功了倒是最好。
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周老湿
5楼2015-05-29 12:42:33
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小小cool

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 日光海 at 2015-05-29 12:42:33
已经向你们公司购买了。发现你们公司质粒还是蛮多的，常用的和一些很少见的质粒都很齐全，而且很便宜。不过，最关键的还是要看是否能出结果啊。要是用你们质粒真做成功了倒是最好。...

嗯嗯，好的，这个质粒我们测序鉴定和酶切鉴定，保证没问题的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

tian150685
6楼2015-05-29 20:16:06
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流水不争

铁杆木虫 (正式写手)

小木虫
引用回帖:
4楼: Originally posted by 日光海 at 2015-05-29 12:39:53
我们实验室没有枯草168.而且枯草方向没什么研究。所以老板不会去买。我们实验室的枯草都是自己分离保存的。不过最近在武汉淼灵生物那找到了pK18mobSacB质粒。这个不错。...

这家公司的质粒好用吗？还用你用Red敲除是怎么做的呀？传授下经验  第一次同源重组同源臂多长
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7楼2015-05-30 08:42:19
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日光海

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 流水不争 at 2015-05-30 08:42:19
这家公司的质粒好用吗？还用你用Red敲除是怎么做的呀？传授下经验  第一次同源重组同源臂多长...

他质粒还没到。到了用过后我再确定回复给你吧。Red敲除有很多综述性文章，已经是个很成熟的敲除体系了，你可以看看。具体的怎么做因实验而异的，目前我还没做完，仍在探索中，一些细节可以共同探讨。我采用上下游同源臂各90bp左右，用overlap PCR将两同源臂与打靶片段连接起来。虽然Red敲除同源臂50bp左右就可以成功，但长片段同源臂无疑是降低假阳性更好的方法。
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周老湿
8楼2015-06-01 08:35:31
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流水不争

铁杆木虫 (正式写手)

小木虫
引用回帖:
8楼: Originally posted by 日光海 at 2015-06-01 08:35:31
他质粒还没到。到了用过后我再确定回复给你吧。Red敲除有很多综述性文章，已经是个很成熟的敲除体系了，你可以看看。具体的怎么做因实验而异的，目前我还没做完，仍在探索中，一些细节可以共同探讨。我采用上下游同 ...

好的 我先也在做这个 敲除框导入不成功 都是假阳性 我们一块做 以后多多交流 嘿嘿
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9楼2015-06-01 22:34:33
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ring02

新虫 (初入文坛)
你好，最近准备用Red做敲除，不知道能不能馈赠一些pRKaraRed质粒，我购买也行。谢谢！
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10楼2015-12-16 12:20:58
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