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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » sanger法测序中放射性元素32P标记dNTP
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harveyguy

新虫 (初入文坛)

[求助] sanger法测序中放射性元素32P标记dNTP 已有1人参与

在一些资料中，关于sanger法测序显影技术，有的说将放射性元素或荧光试剂标记特异性的引物，或者在四种ddNTP标记不同的荧光试剂，或者在ddNTP上标记放射性元素，这些都很好理解，但是在一本参考书中说在四种dNTP中的其中一个上标记32P，然后进行电泳，放射性自显影，感觉这样做好像不太对吧，如果模板链是3'—ACGTTCA——5' 测序结果应是5‘--TGCAAGT-3’ 如果用32P只标记dATP的话，那么电泳之后不含dATP的短链就不会显影啊？请大拿帮解答下下。万分感谢！
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1楼 2015-05-25 16:48:34
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harveyguy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2015-05-26 10:00:02
只要片段中含有 hot dATP, 掺入其他dNTP的时候，这条链整个也是有放射性的，所以也能被检测到。

极端情况，新合成的链完全不含A，那的确看不到了。

fred.sanger在最初介绍该方法时是首先将ddTTP+dTTP,模板，引物，和其他三种dNTP（其中一种带有放射性32P标记）反应，然后电泳，放射性自显影检测，同理将ddTTP+dTTP换成ddATP+dATP，......，依次在进行电泳和放射性自显影，这样做的话是不是也存在新合成的链完全不含放射性标记，请问大侠这是不是最初sanger法的一个缺陷，之后又进行了改进？谢谢大侠
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3楼2015-05-26 11:04:47
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-05-26 11:24:04
只要片段中含有 hot dATP, 掺入其他dNTP的时候，这条链整个也是有放射性的，所以也能被检测到。

极端情况，新合成的链完全不含A，那的确看不到了。
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2015-05-26 10:00:02
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

在合成之后，整个的混合物是要跑电泳的（尿素变性电泳，bp的区分级别），
所以如果加入的ddXTP, dXTP不对的话，是没有办法延伸的，就是说电泳到此就不会有更长的链。

原理上来讲，就是每个碱基试错，一直加入得碱基对了，再往下一个碱基，如此循环，如果非要说drawback, 就是非常繁琐，而且由于电泳限制，大概300bp之后，就失去了分辨率了。

他因此而得了第一次诺贝尔奖，这个思路一直到ABI的bigDye测序，到现在的NGS测序，都被沿用下来，只是变得自动化了，更快，更准。
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行至水穷处，坐看云起时
4楼2015-05-26 12:40:31
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