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harveyguy

新虫 (初入文坛)

[求助] sanger法测序中放射性元素32P标记dNTP 已有1人参与

在一些资料中,关于sanger法测序显影技术,有的说将放射性元素或荧光试剂标记特异性的引物,或者在四种ddNTP标记不同的荧光试剂,或者在ddNTP上标记放射性元素,这些都很好理解,但是在一本参考书中说在四种dNTP中的其中一个上标记32P,然后进行电泳,放射性自显影,感觉这样做好像不太对吧,如果模板链是3'—ACGTTCA——5' 测序结果应是5‘--TGCAAGT-3’ 如果用32P只标记dATP的话,那么电泳之后不含dATP的短链就不会显影啊?请大拿帮解答下下。万分感谢!
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harveyguy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2015-05-26 10:00:02
只要片段中含有 hot dATP, 掺入其他dNTP的时候,这条链整个也是有放射性的,所以也能被检测到。

极端情况,新合成的链完全不含A,那的确看不到了。

fred.sanger在最初介绍该方法时是首先将ddTTP+dTTP,模板,引物,和其他三种dNTP(其中一种带有放射性32P标记)反应,然后电泳,放射性自显影检测,同理将ddTTP+dTTP换成ddATP+dATP,......,依次在进行电泳和放射性自显影,这样做的话是不是也存在新合成的链完全不含放射性标记,请问大侠这是不是最初sanger法的一个缺陷,之后又进行了改进?谢谢大侠
3楼2015-05-26 11:04:47
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-05-26 11:24:04
只要片段中含有 hot dATP, 掺入其他dNTP的时候,这条链整个也是有放射性的,所以也能被检测到。

极端情况,新合成的链完全不含A,那的确看不到了。
行至水穷处,坐看云起时
2楼2015-05-26 10:00:02
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

在合成之后,整个的混合物是要跑电泳的(尿素变性电泳,bp的区分级别),
所以如果加入的ddXTP, dXTP不对的话,是没有办法延伸的,就是说电泳到此就不会有更长的链。

原理上来讲,就是每个碱基试错,一直加入得碱基对了,再往下一个碱基,如此循环,如果非要说drawback, 就是非常繁琐,而且由于电泳限制,大概300bp之后,就失去了分辨率了。

他因此而得了第一次诺贝尔奖,这个思路一直到ABI的bigDye测序,到现在的NGS测序,都被沿用下来,只是变得自动化了,更快,更准。
行至水穷处,坐看云起时
4楼2015-05-26 12:40:31
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