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Cindycclove

新虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-05-27 09:48:33
首先,你的模板有问题吧,不同时间反转录结果不稳定,既然做了温度梯度和模板浓度梯度,照理说,应该能确定最佳温度和模板浓度吧,如果确定不了,说明就不是温度和模板浓度的原因,引物本身的合理性就存在问题,扩 ...

昨天做了一个touchdownPcr 65-50度的,然后出来了目的条带,没有引物二聚体,也没有非特异性扩增了~︿( ̄︶ ̄)︿就是条带不太亮,加5ul都没有1ul marker亮~
今天把昨天产物稀释了梯度作为2次PCR模板,希望有好的结果~
谢谢~~~
模板能有什么问题呢,降解很严重倒是真的~
11楼2015-05-27 10:35:57
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凤凰城边

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可以直接用56,57度的扩增产物溶解之后在进行扩增看看效果怎么样。降解的RNA不好在做扩增了,不过有条带就说明有模板。实在不行重新设计引物在试试
爱拼才会赢
12楼2015-05-27 10:52:58
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Cindycclove

新虫 (小有名气)

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12楼: Originally posted by 凤凰城边 at 2015-05-27 10:52:58
可以直接用56,57度的扩增产物溶解之后在进行扩增看看效果怎么样。降解的RNA不好在做扩增了,不过有条带就说明有模板。实在不行重新设计引物在试试

我有2个问题想请教,1.我做TouchdownPCR有目的条带,65降落到50度,我想用这个条带做2次pcr,那么2次PCR还是用touchdown的程序还是用以前做温度梯度时候的程序(个人觉得温度梯度出现的条带是非特异性扩增)
2.26日晚上TDpcr的产物放-20度保存9当时电泳是有条带的),今天早上重新电泳就弥撒了,昨天用它做模板2次扩增了,产物就是弥散的。怎么会出现这种情况呢?
13楼2015-05-28 14:58:59
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凤凰城边

银虫 (正式写手)


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引用回帖:
13楼: Originally posted by Cindycclove at 2015-05-28 14:58:59
我有2个问题想请教,1.我做TouchdownPCR有目的条带,65降落到50度,我想用这个条带做2次pcr,那么2次PCR还是用touchdown的程序还是用以前做温度梯度时候的程序(个人觉得温度梯度出现的条带是非特异性扩增)
2.26 ...

1. 直接用产物进行2次PCR,就按照56,57度进行。你的反转录PCR没必要这么高温度。
2. 弥散说明有问题。这个就需要排除各种因素了,像电泳缓冲液,模板质量,引物特异性。实在不行的话,可以进行两部法反转录,先反转录CDNA,在扩增你的基因
爱拼才会赢
14楼2015-05-29 08:48:06
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没想好名字

新虫 (初入文坛)


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你可以这么试一下:首先TM-3度P一次,看看有没有条带,如果什么都没有的话,可以改用TM-8X5+TM-2X30试一下,如果还是什么都没有,就直接换引物了。如果有的话就一步步优化条件。不过话说你用储存液的样本提取RNA不太好吧,RNA很容易降解的,你应该尽早反转录
15楼2015-05-29 11:30:18
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Cindycclove

新虫 (小有名气)

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15楼: Originally posted by 没想好名字 at 2015-05-29 11:30:18
你可以这么试一下:首先TM-3度P一次,看看有没有条带,如果什么都没有的话,可以改用TM-8X5+TM-2X30试一下,如果还是什么都没有,就直接换引物了。如果有的话就一步步优化条件。不过话说你用储存液的样本提取RNA不太 ...

是啊,我查到说样品离开原来的宿主环境就开始降解了,我觉得最大的问题是在这里。
16楼2015-06-01 17:43:04
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清语浅秋

新虫 (初入文坛)


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想咨询一下大家是如何做原核表达的,载体是PGEX-5X-1,第一次做,几个月了,还是没出现转化子
17楼2015-06-02 12:15:54
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calorimetry

铜虫 (正式写手)


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PCR的反应很灵敏,模板纯净当然扩增效果好。
可以改善RNA作为反转录模板的质量,防止降解。
从提取RNA一开始就选择性的使用RNase的蛋白质变性试剂(如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂)、蛋白水解酶(如蛋白酶K)和能够与蛋白质结合阴离子去污剂(比如SDS、脱氧胆酸等),并且联合使用RNase的特异性抑制剂(比如RNasin、DEPC等),能最大限度地防止能源性RNase对于RNA的降解。另外,在变性液中加入Beta 巯基乙醇,DTT等还原剂也可以破坏RNase的二硫键,有利于RNase的变性、水解和灭活。

另外,反正你能够扩增出目的DNA,就直接从电泳上的目的带回收出来目的DNA,用它再做PCR。
18楼2015-06-02 12:56:45
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方天翼614

新虫 (小有名气)


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用的引物浓度是多少啊?我也遇见过这种情况,后来发现我用的引物工作浓度100um,后来稀释到10uM,目的条带亮多了,二聚体也不明显了!你可以试试

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19楼2017-04-05 15:33:03
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