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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的条带暗，引物二聚体明亮，如何优化？
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Cindycclove

新虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-05-27 09:48:33
首先，你的模板有问题吧，不同时间反转录结果不稳定，既然做了温度梯度和模板浓度梯度，照理说，应该能确定最佳温度和模板浓度吧，如果确定不了，说明就不是温度和模板浓度的原因，引物本身的合理性就存在问题，扩 ...

昨天做了一个touchdownPcr 65-50度的，然后出来了目的条带，没有引物二聚体，也没有非特异性扩增了~︿(￣︶￣)︿就是条带不太亮，加5ul都没有1ul marker亮~
今天把昨天产物稀释了梯度作为2次PCR模板，希望有好的结果~
谢谢~~~
模板能有什么问题呢，降解很严重倒是真的~
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11楼2015-05-27 10:35:57
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凤凰城边

银虫 (正式写手)
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可以直接用56,57度的扩增产物溶解之后在进行扩增看看效果怎么样。降解的RNA不好在做扩增了，不过有条带就说明有模板。实在不行重新设计引物在试试
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爱拼才会赢
12楼2015-05-27 10:52:58
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Cindycclove

新虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by 凤凰城边 at 2015-05-27 10:52:58
可以直接用56,57度的扩增产物溶解之后在进行扩增看看效果怎么样。降解的RNA不好在做扩增了，不过有条带就说明有模板。实在不行重新设计引物在试试

我有2个问题想请教，1.我做TouchdownPCR有目的条带，65降落到50度，我想用这个条带做2次pcr，那么2次PCR还是用touchdown的程序还是用以前做温度梯度时候的程序（个人觉得温度梯度出现的条带是非特异性扩增）
2.26日晚上TDpcr的产物放-20度保存9当时电泳是有条带的），今天早上重新电泳就弥撒了，昨天用它做模板2次扩增了，产物就是弥散的。怎么会出现这种情况呢？
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13楼2015-05-28 14:58:59
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凤凰城边

银虫 (正式写手)
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13楼: Originally posted by Cindycclove at 2015-05-28 14:58:59
我有2个问题想请教，1.我做TouchdownPCR有目的条带，65降落到50度，我想用这个条带做2次pcr，那么2次PCR还是用touchdown的程序还是用以前做温度梯度时候的程序（个人觉得温度梯度出现的条带是非特异性扩增）
2.26 ...

1. 直接用产物进行2次PCR，就按照56,57度进行。你的反转录PCR没必要这么高温度。
2. 弥散说明有问题。这个就需要排除各种因素了，像电泳缓冲液，模板质量，引物特异性。实在不行的话，可以进行两部法反转录，先反转录CDNA，在扩增你的基因
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爱拼才会赢
14楼2015-05-29 08:48:06
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没想好名字

新虫 (初入文坛)
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你可以这么试一下：首先TM-3度P一次，看看有没有条带，如果什么都没有的话，可以改用TM-8X5+TM-2X30试一下，如果还是什么都没有，就直接换引物了。如果有的话就一步步优化条件。不过话说你用储存液的样本提取RNA不太好吧，RNA很容易降解的，你应该尽早反转录
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15楼2015-05-29 11:30:18
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Cindycclove

新虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by 没想好名字 at 2015-05-29 11:30:18
你可以这么试一下：首先TM-3度P一次，看看有没有条带，如果什么都没有的话，可以改用TM-8X5+TM-2X30试一下，如果还是什么都没有，就直接换引物了。如果有的话就一步步优化条件。不过话说你用储存液的样本提取RNA不太 ...

是啊，我查到说样品离开原来的宿主环境就开始降解了，我觉得最大的问题是在这里。
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16楼2015-06-01 17:43:04
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清语浅秋

新虫 (初入文坛)
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想咨询一下大家是如何做原核表达的，载体是PGEX-5X-1，第一次做，几个月了，还是没出现转化子
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17楼2015-06-02 12:15:54
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
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PCR的反应很灵敏，模板纯净当然扩增效果好。
可以改善RNA作为反转录模板的质量，防止降解。
从提取RNA一开始就选择性的使用RNase的蛋白质变性试剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白水解酶（如蛋白酶K）和能够与蛋白质结合阴离子去污剂（比如SDS、脱氧胆酸等），并且联合使用RNase的特异性抑制剂（比如RNasin、DEPC等），能最大限度地防止能源性RNase对于RNA的降解。另外，在变性液中加入Beta 巯基乙醇，DTT等还原剂也可以破坏RNase的二硫键，有利于RNase的变性、水解和灭活。

另外，反正你能够扩增出目的DNA，就直接从电泳上的目的带回收出来目的DNA，用它再做PCR。
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18楼2015-06-02 12:56:45
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方天翼614

新虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用的引物浓度是多少啊？我也遇见过这种情况，后来发现我用的引物工作浓度100um,后来稀释到10uM，目的条带亮多了，二聚体也不明显了！你可以试试

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19楼2017-04-05 15:33:03
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