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新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 45.5
帖子: 6
在线: 3小时
虫号: 3199474
注册: 2014-05-12
专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 质粒串联表达，第二个基因一直连接不上，而且现象奇怪已有2人参与

最近遇到怪事，本人现在正在做两个基因的串联表达，所用的表达载体是实验室自己构建的
首先串联第一个基因A，比较顺利的连接上
再串联第二个基因B，一直连不上，但是每次转化平板总是长很多转化子，但是挑出来都是假阳性，检查过酶切位点都没有什么问题
本来怀疑是第一个串联了A基因的质粒保存出现了问题，然后提质粒，酶切，PCR都显示质粒没问题
再串联B时挑取转化子，用A的上游和B的下游P显示为假阳性，

没有条带，但是很奇怪的是用A的上下游P也没有条带，按理说空载也是带有A基因的载体呀！这是怎么回事苦恼！

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1楼 2015-05-18 19:34:26

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404160169

新虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 24.9
帖子: 27
在线: 10.3小时
虫号: 1000175
注册: 2010-04-18
性别: MM
专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

我们基因串联表达，酶切，酶连都很正常你要确定你选的酶切位点的酶是否有甲基化现象，酶切条件是否正常。

3楼2015-11-17 16:35:58

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viki_MDK

银虫 (正式写手)

应助: 34 (小学生)
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散金: 573
红花: 1
帖子: 897
在线: 541.4小时
虫号: 1317798
注册: 2011-06-08
专业: 蛋白质组学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

那试一试先把两个基因PCR先融合起来，在连接表达质粒。

2楼2015-05-19 09:08:15

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