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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 扩增片段大小约5Kb的cDNA片段
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半半911

新虫 (小有名气)

[求助] 扩增片段大小约5Kb的cDNA片段 已有2人参与

本人最近实验要扩增一段约5Kb的cDNA（其中有1Kb左右GC含量比较高，约70%），试过各种酶都没有效果（La taq， La with GC buffer,  primer star， primer star GXL），请问有扩增 过这种片段的经验的怎么解决？或者帮忙推荐哪个公司可以提供扩增这种大片段的技术服务。谢谢！！！
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1楼 2015-05-02 20:11:14
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-05 22:44:20
我也遇到过这种情况，解决方案可能有两个。一个是酶，曾经用过takara的一种酶扩增效率很高，但保真性没有那么好。不记得全称了，好像室友Amp这几个字母，你可以查查，推荐一下。第二个是你的反应体系和程序，引物多合成两对，PCR程序多试试。另外，如果只是想得到序列不做下一步，建议分段扩增。

基因克隆是个耐心活。祝顺利。
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2楼2015-05-03 16:00:46
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
半半911: 金币+5, ★有帮助 2015-05-03 21:13:33
建议：用NEB公司的phusion酶，用其自带的GC buffer或其他公司的GC buffer均可。扩增时退火温度设定为引物Tm值+2度，其它条件按说明书进行。该酶对扩增长片段很有效，且保真性超高。祝你好运！
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3楼2015-05-03 16:56:46
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
KOD FX 酶。
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。
4楼2015-05-03 20:59:24
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半半911

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-05-03 16:00:46
我也遇到过这种情况，解决方案可能有两个。一个是酶，曾经用过takara的一种酶扩增效率很高，但保真性没有那么好。不记得全称了，好像室友Amp这几个字母，你可以查查，推荐一下。第二个是你的反应体系和程序，引物多 ...

就是想得到基因的全长，接下来做酵母双杂，过表达等
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5楼2015-05-03 21:14:25
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半半911

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lixg at 2015-05-03 16:56:46
建议：用NEB公司的phusion酶，用其自带的GC buffer或其他公司的GC buffer均可。扩增时退火温度设定为引物Tm值+2度，其它条件按说明书进行。该酶对扩增长片段很有效，且保真性超高。祝你好运！

接下来去订购一个试试
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6楼2015-05-03 21:14:51
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fungi886

银虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-05 22:44:46
觉得cDNA的质量才是关键，好的话还是很容易扩出来的，还有现在有些反转录试剂盒用的引物是随机引物，不是oligo dT,可能会拉不出全长
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7楼2015-05-04 09:05:51
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半半911

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fungi886 at 2015-05-04 09:05:51
觉得cDNA的质量才是关键，好的话还是很容易扩出来的，还有现在有些反转录试剂盒用的引物是随机引物，不是oligo dT,可能会拉不出全长

我用的TAKARA的反转录试剂盒就是要求用Random primers
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8楼2015-05-04 14:24:44
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fungi886

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 半半911 at 2015-05-04 14:24:44
我用的TAKARA的反转录试剂盒就是要求用Random primers...

我也一直用的是TAKARA的试剂盒，之前是有两种选择的，现在的确是像楼主说的只提供Random primers。我很久没扩cDNA全长了，不知道这样好不好用，但只要你想想就会明白，用这种引物扩出的模板肯定都是小片段的，在某种程度上降低了长片段扩出的概率，在我印象中5kb的cDNA本来就不好弄。只是个人意见
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9楼2015-05-06 08:33:13
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
一般的热启动酶 高保真酶就能很好的扩增了呀，，，你有1kbGC含量高，注意优化buffer，镁离子浓度进行摸索，此外，引物 模板你都确定是完美的吗？都要考虑好啊，毕竟是分子实验，多方面考虑
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-05-06 08:55:31
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