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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » rt-pcr引物设计问题（新手求助，5555）
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清晨初日

铜虫 (小有名气)

[求助] rt-pcr引物设计问题（新手求助，5555） 已有1人参与

NCBI上面检索到的基因序列，起始密码子前面和终止密码子后面都还有碱基，那我设计上下游引物的时候，是去掉这些碱基从起始密码子开始设计引物，还是应该怎样做？
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学渣逆袭，都闪开
1楼 2015-04-21 21:51:41
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
清晨初日: 金币+10 2015-04-23 11:17:41
你的最终目的是要构建表达载体吗？你查到的应该是cDNA序列，起始密码子、终止密码子两侧分别是5‘UTR、3'UTR，如果起始密码子开始的引物特异性、扩增效率很好，那就直接从起始密码子开始，如果不好，也可以在UTR区设计，扩增出来连到T载后，以其为模板再用起始密码子开始的引物扩。
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2楼2015-04-22 11:44:31
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森林独行者

新虫 (初入文坛)
不需要去除，你选的是CDS区，直接设计就可以
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3楼2015-04-23 10:09:09
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清晨初日

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 森林独行者 at 2015-04-23 10:09:09
不需要去除，你选的是CDS区，直接设计就可以

起始密码子和终止密码子之间才是cds区啊，那我就是从这两个密码子开始？不管前后其他的序列？
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学渣逆袭，都闪开
4楼2015-04-23 11:18:55
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清晨初日

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-04-22 11:44:31
你的最终目的是要构建表达载体吗？你查到的应该是cDNA序列，起始密码子、终止密码子两侧分别是5‘UTR、3'UTR，如果起始密码子开始的引物特异性、扩增效率很好，那就直接从起始密码子开始，如果不好，也可以在UTR区设 ...

构建重组质粒。那下游引物是不是类似，也可以在3‘UTR区开始设计引物？“在UTR区设计，扩增出来连到T载后，以其为模板再用起始密码子开始的引物扩。”您的意思是还要再合成起始密码子开始的引物？
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学渣逆袭，都闪开
5楼2015-04-23 11:45:51
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 清晨初日 at 2015-04-23 11:45:51
构建重组质粒。那下游引物是不是类似，也可以在3‘UTR区开始设计引物？“在UTR区设计，扩增出来连到T载后，以其为模板再用起始密码子开始的引物扩。”您的意思是还要再合成起始密码子开始的引物？...

对，因为有的时候起始密码子开始的引物用cDNA或DNA做模板扩增时效率低，用UTR区的高效率引物扩出序列连到载体后，以载体质粒为模板扩增效率会高很多。
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6楼2015-04-23 13:30:15
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清晨初日

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by stone2239 at 2015-04-23 13:30:15
对，因为有的时候起始密码子开始的引物用cDNA或DNA做模板扩增时效率低，用UTR区的高效率引物扩出序列连到载体后，以载体质粒为模板扩增效率会高很多。...

这样要合成2条引物岂不是很麻烦？我还是尽量用起始密码子开始对吧？
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学渣逆袭，都闪开
7楼2015-04-23 15:54:14
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 清晨初日 at 2015-04-23 15:54:14
这样要合成2条引物岂不是很麻烦？我还是尽量用起始密码子开始对吧？...

恩，是的。
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8楼2015-04-23 16:44:18
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