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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 请教包涵体蛋白柱上复性的具体操作步骤，毕业急用，多多帮忙
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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 请教包涵体蛋白柱上复性的具体操作步骤，毕业急用，多多帮忙 已有2人参与

我的蛋白时包涵体蛋白，想通过复性把其转变为可溶性的蛋白 ，看了很多文献，说柱上复性比较好，透析方法试了三种结果均非常的不理想，关乎毕业事宜，还请做过得 或者知道的各位多多帮忙啊，感激不尽
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1楼 2015-04-08 16:26:29
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-04-08 19:37:55
Inclusion bodies were separated from the cytosolic protein pool by centrifugation at 20,000 g for 30 min, and the inclusion bodies-containing pellet was solubilized with 4 ml of solubilization buffer ...

thank you for your attention
Some details need to be confirmed：
1,Urea is a denaturant, whether the protein is denatured after dissolution
2,The need for  agitation when constant rotated？
3,the sample was spun at 25,000 g for 30 min to remove any insoluble material ,so The supernatant is  the soluble protein，right？
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6楼2015-04-09 09:26:38
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-09 08:24:17
Inclusion bodies were separated from the cytosolic protein pool by centrifugation at 20,000 g for 30 min, and the inclusion bodies-containing pellet was solubilized with 4 ml of solubilization buffer (6 M Urea, 200 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3), supplemented with 10 μM β-mercaptoethanol and incubated overnight at 4°C under constant rotation. Thereafter, the sample was spun at 25,000 g for 30 min to remove any insoluble material and the His-tagged protein was purified using HisPurTM Ni-NTA Resin

Hope it works with you. Good luck!
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2楼2015-04-08 19:37:55
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15871472357

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2015-04-09 08:24:22
包涵体洗涤
1）各取超裂液 1485μL加入 1.5mL 离心管中，加 20%DOC 储存液至终浓度为 0.2%。加 1mol/L 的 DTT 储存液至终浓度 0.6mmol/L，充分混匀。4℃静置 10min 以上。
2）12000 r/min 离心 5min。
3）加入 PBS 1350μL、20%DOC 储存液至终浓度为 2%，充分重悬沉淀。室温静置 10min 以上。
4）12000 r/min 离心 5min，弃上清。
5）加入 PBS1350μL、20%DOC 储存液至终浓度为 2%，充分重悬沉淀。室温静置 10min 以上。
6）12000 r/min 离心 5min，弃上清。
取离心沉淀用预冷的 PBS 重悬，SDS-PAGE 分析包涵体洗涤情况
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3楼2015-04-08 22:41:27
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15871472357 at 2015-04-08 22:41:27
包涵体洗涤
1）各取超裂液 1485μL加入 1.5mL 离心管中，加 20%DOC 储存液至终浓度为 0.2%。加 1mol/L 的 DTT 储存液至终浓度 0.6mmol/L，充分混匀。4℃静置 10min 以上。
2）12000 r/min 离心 5min。
3）加入 P ...

非常感谢你的帮助，我想问一下这样洗涤包涵体得到的就是比较纯的包涵体吗？doc与dtt的作用示什么呢？我一般都是离心菌液获得包涵体，然后进行超声破碎然后进行纯化。那你这样洗涤完以后得到的是包涵体还是可溶性蛋白？
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4楼2015-04-09 09:10:20
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