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hehanhan

金虫 (初入文坛)

[交流] 请教普通PCR问题

本人现在做普通PCR,跑电泳的结果一直不理想,希望大家给些意见,希望早点做出结果的,谢谢啦

体系(25μL)
ddH2O          18
primer1         0.5
primer2         0.5
10×buffer      2.5
Taq 酶           0.5
dNTP             1
模板              2

电泳图最左侧1是Marker,下来的2、3退火温度是55度,4、5是55.5度,6、7是56度、8、9是57度,麻烦大家指导点了

请教普通PCR问题
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470642365mm

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-02 23:37:05
杂带多,①可以先提高退火温度试试,比如60℃;②还可能是引物特异性差,可以重新设计引物;③还有就是模板质量问题了。楼主可以根据自己PCR产物的分子量大小(根据marker判断)是否正确啊
16楼2015-04-02 21:42:41
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浩远天涯

金虫 (小有名气)

★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-02 23:36:08
我感觉楼主引物设计的不很好呢,有杂带,说明PCR产物不纯。
体系应该没什么问题。
6楼2015-04-01 21:14:58
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lxzk

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
体系没问题,第一模板可以少用一些,不行的话第二重新设计引物提高Tm值。
9楼2015-04-01 23:50:01
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-02 23:36:27
图片看着结果还行啊,目的条带是中间那个亮带吧,目的条带出来了57℃跑的好像杂带是最少的了,可以试着再升高一些温度看看,还有特异性杂带多的话,可能是模板不纯,或是使用特异性较高的酶,如热启动Taq聚合酶
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-04-02 08:55:54
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