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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教普通PCR问题
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hehanhan

金虫 (初入文坛)

[交流] 请教普通PCR问题

本人现在做普通PCR，跑电泳的结果一直不理想，希望大家给些意见，希望早点做出结果的，谢谢啦

体系（25μL）
ddH2O          18
primer1         0.5
primer2         0.5
10×buffer      2.5
Taq 酶           0.5
dNTP             1
模板              2

电泳图最左侧1是Marker,下来的2、3退火温度是55度，4、5是55.5度,6、7是56度、8、9是57度，麻烦大家指导点了

请教普通PCR问题
0401A.jpg
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1楼 2015-04-01 20:42:00
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不问来路

银虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-02 23:36:49
这应该是非特异性扩增吧，我做梯度一般是正负5度，也就是10度的跨度来做。
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13楼2015-04-02 16:12:20
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浩远天涯

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-02 23:36:08
我感觉楼主引物设计的不很好呢，有杂带，说明PCR产物不纯。
体系应该没什么问题。
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6楼2015-04-01 21:14:58
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lxzk

木虫 (正式写手)
★
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体系没问题，第一模板可以少用一些，不行的话第二重新设计引物提高Tm值。
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9楼2015-04-01 23:50:01
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-02 23:36:27
图片看着结果还行啊，目的条带是中间那个亮带吧，目的条带出来了57℃跑的好像杂带是最少的了，可以试着再升高一些温度看看，还有特异性杂带多的话，可能是模板不纯，或是使用特异性较高的酶，如热启动Taq聚合酶
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-04-02 08:55:54
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