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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 急！急！急！第一次做PCR条带，求各师哥师姐给看看
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黑西虾虾

新虫 (初入文坛)

[求助] 急！急！急！第一次做PCR条带，求各师哥师姐给看看 已有4人参与

这是我做的PCR条带
我用的酶是ExTaq
体系（50微升）：酶                     0.5
                           引物1、引物2：各4
                          buffer：                5
                          dntp:                    5
                          水                           27.5
                          模板：                  4
我想问 ：1.我的PCR条带中marker条带为什么有拖尾？
               2.我的marker条带数很多，这个正常么？我用的marker-dL2000，求指教

急！急！急！第一次做PCR条带，求各师哥师姐给看看
PCR.png
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1楼 2015-03-25 13:03:20
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
呵呵，跑的不错啊，marker虽有稍微拖尾，但是不错，胶的浓度是多少呢 可能有点关系，或者是它本身的问题吧
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-03-25 13:12:08
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-26 22:12:06
黑西虾虾: 金币+4, ★★★很有帮助, 给的建议对我很有帮助，可是建议有些给的太多了，只需要回答跟我问题有关的就行了 2015-03-29 15:11:25
首先，跑的带不错，给几个建议：
1、引物加的太多，50  μ L 体系中10 μM 引物上下游分别加2  μL就好了；
2、dNTP加的太多，50  μL 体系加1  μL 就好了；
3、模板也加多了，50  μ L 体系中20 ng/ μL加2 μ L足矣。
4、你这个Marker不是DL2000，DL2000是6条带，分别是2000，,1000,750,500,200,100，其中750带最亮。
5、Marker拖尾除了电泳本身的问题（你这个电泳没有问题的），一般只有一个解释，那就是使用时间长了，部分降解所致。
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没有做不到，只有想不到！
3楼2015-03-25 13:22:44
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-28 23:28:15
marker不是-dL2000，换个其他marker试试，确定下目的片段长度就没事了。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-03-25 13:29:05
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黑西虾虾

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-25 13:12:08
呵呵，跑的不错啊，marker虽有稍微拖尾，但是不错，胶的浓度是多少呢 可能有点关系，或者是它本身的问题吧

我的胶浓度是0.6%，0.6克琼脂糖加入100ml1*TAE（其中1*TAE是用之前师兄师姐跑过多次胶回收来的），要是这个胶浓度有影响的话，我的扩增DNA片段不应该也会拖尾很长么？
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5楼2015-03-25 15:41:41
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-03-26 22:12:28
引用回帖:
5楼: Originally posted by 黑西虾虾 at 2015-03-25 15:41:41
我的胶浓度是0.6%，0.6克琼脂糖加入100ml1*TAE（其中1*TAE是用之前师兄师姐跑过多次胶回收来的），要是这个胶浓度有影响的话，我的扩增DNA片段不应该也会拖尾很长么？...

你可以先换个其他marker试试，也可能是你的胶局部制得不好吧（可能和TAE有关），也是有可能的。你的TAE跑电泳用多次可以，如果制胶的话，最好用新的，不然分子实验本身就看不见摸不着的，一出问题还得分析找原因，估计
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
6楼2015-03-25 15:52:36
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
黑西虾虾: 金币+6, ★★★很有帮助, 给的建议对我很有帮助 2015-03-29 15:09:19
引用回帖:
5楼: Originally posted by 黑西虾虾 at 2015-03-25 15:41:41
我的胶浓度是0.6%，0.6克琼脂糖加入100ml1*TAE（其中1*TAE是用之前师兄师姐跑过多次胶回收来的），要是这个胶浓度有影响的话，我的扩增DNA片段不应该也会拖尾很长么？...

另外，0.6%的胶适合分离的marker范围是800--12000，所以胶浓度也要考虑其中哦
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-03-25 15:55:22
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aini_222925

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-28 23:28:37
引物加的太多了，不知道你的引物浓度是多少？一般10uM的引物加1ul就可以了。
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我是疯子我怕谁
8楼2015-03-26 17:17:15
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蓝色的心情79

新虫 (初入文坛)
marker 应该不是2000的， 2000的跑出来一共有六条带，分别是100,250,500,750,1000,2000. marker有拖尾的现象可能是你胶的问题。再者， 引物太多，可以试试1ul.
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9楼2015-04-03 08:21:39
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