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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒分别酶切均有正确条带，但双酶切只有一条条带，这是怎么回事？
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紫玉涵轩

铜虫 (小有名气)

[求助] 质粒分别酶切均有正确条带，但双酶切只有一条条带，这是怎么回事？ 已有3人参与

我的片段长度为5400bp左右，连接到POK12载体，载体长度为2400bp。由于长片段连接太难，所以我将片段一分为二，分别为3200bp和2600bp。分别连接入pok中。再将两段连接起来。经PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒进行酶切鉴定。片段1的双酶切为MluI和NdeI，片段2的双酶切为NdeI和EcoRV；同时使用MluI和EcoRV对整个片段进行酶切。第一行为片段1的双酶切，第二行为片段2的双酶切，均有目的条带，第三行为整个片段的酶切，但是没有pok质粒条带，只有单一的一条带，三个酶切使用的是同一个质粒，请问这是怎么回事？我到底是连上了还是没连上啊……请大家帮忙看一下分析一下其中的问题。Marker从上到下的大小为5000，3000，2000，1500，800，500，300

质粒分别酶切均有正确条带，但双酶切只有一条条带，这是怎么回事？
20150318-2.jpg
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1楼 2015-03-18 17:36:31
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whdxhxy

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 紫玉涵轩 at 2015-03-19 09:12:51
我昨天查询了两个酶的buffer，发现效率分别只有10%和25%，今天打算重提质粒用正确的buffer 做一下酶切看看，谢谢您的提示！我想问一下，如果两个酶使用的buffer不一样，应该怎样进行双酶切？...

当然要找两个酶效率都高的buffer，不行就分步切，这些在设计的时候都是要考虑的。

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2015-03-19 14:27:47
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whdxhxy

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-19 15:31:21
首先，你第一行和第二行分别酶切之后的结果你没发现条带比较杂吗？根据胶图分析，分别酶切时切割不完全，既有切下来的目的条带，还有单酶切的条带。最后用两边双酶切之后出现了一条带，极有可能是这两个酶有一个切割效率低或者是buffer不合适。
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2楼2015-03-18 20:57:19
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主分析一下质粒的酶切位点。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-03-18 23:54:57
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紫玉涵轩

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by whdxhxy at 2015-03-18 20:57:19
首先，你第一行和第二行分别酶切之后的结果你没发现条带比较杂吗？根据胶图分析，分别酶切时切割不完全，既有切下来的目的条带，还有单酶切的条带。最后用两边双酶切之后出现了一条带，极有可能是这两个酶有一个切割 ...

我昨天查询了两个酶的buffer，发现效率分别只有10%和25%，今天打算重提质粒用正确的buffer 做一下酶切看看，谢谢您的提示！我想问一下，如果两个酶使用的buffer不一样，应该怎样进行双酶切？
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4楼2015-03-19 09:12:51
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