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liaona

铜虫 (小有名气)

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[求助] 细菌PCR总是点的有些样不出条带已有6人参与

提取土壤总DNA，利用细菌V6-V8区引物968F/1401R进行PCR扩增，点的样总是有那么几个不出条带，不清楚什么情况，有师姐说是我做PCR加样操作出问题，可是每次做8个，加样操作都是一样的啊，怎么就有些样p出来，有些没有出来呢。PCR25ul体系：上下游引物各1.5ul，2.5mM each dNTPs 2ul，10xPCR Buffer 2.5 ul，Taq聚合酶0.25ul，模板DNA 2 ul，无菌水 15.25 ul。PCR扩增条件：94 oC变性5min,接着20个循环（94 oC变性1 min，67 oC退火1 min，72 oC延伸1 min，每个循环退火温度降0.5 oC），接着 15个循环（94 oC变性1 min，57oC退火1 min，72 oC延伸1 min，每个循环退火温度降0.5 oC），最后再72 oC延伸10 min。

10.30.2.jpg

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求助PCR老是跑不出条带已经有16人回复

1楼2015-03-16 17:37:35

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ahuasuo123

金虫 (著名写手)

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楼主，看了一下你的体系和程序，可能有以下几个问题：首先，引物浓度有点大了，引物浓度太大有时会影响扩增的，你的25微升的体系可以加0.5～1微升。其次模板量太大了，模板你可以用核酸定量仪测一下，也可以用分光光度计测，像你25微升的体系加25ng就足够了。再其次，你的退火温度开始太高了，普通的taq酶扩增能力很强，五十五度，不用梯度就可以。再其次，你确定一下你用的taq酶的浓度，我感觉是高了，普通没有预混的taq酶的浓度是很高的，酶浓度过高影响扩增效率。再其次，如果pcr仪不是很好的话，放在边缘上的样品有时会发生扩增不出来的现象！
所以，总的建议是，25微升体系，引物加1微升，根据taq酶的说明书按照标准加酶，退火不用梯度，直接55度30个循环，总一个EP管，把样全在一个管子加好，最后分装！最后把样都放在pcr仪的中间处！
祝你好运！

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