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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 求助！急包涵体纯化！
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cs99900810

银虫 (小有名气)

[求助] 求助！急包涵体纯化！ 已有3人参与

本人现在在做一个包涵体纯化，NI柱纯化，用尿素溶解蛋白，现在主要存在两个问题
1 目的蛋白与镍柱结合效率不高
2纯化后仍有杂带
因为是新手想问问大家是否有其他的方法能除去杂蛋白，能否用咪唑进行纯化，希望方法不要复杂，因为我现在没有分子筛纯化的试剂与仪器，也没有离子交换的有关东西
我不希望是复制粘贴的东西，如果真的能帮到我 我会追加金币。另外我手上只有3kD的超滤管
图片最后一个泳道是我的纯化后蛋白，最上面的条带为我的目的蛋白，约45KD左右
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1楼 2015-03-10 17:28:37
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九字江山

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cs99900810(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-03-10 22:36:57
cs99900810: 金币+2 2015-03-11 08:51:46
1. 挂不上柱就延长一下挂柱时间。
2. 这张图上哪个是你的目的蛋白条带啊？是不是最后一张图的第二条？好歹P个箭头啊。。。你这个蛋白应该是降解的问题，试试把His放到C端试试。
3. 纯化包涵体时，用不同浓度的尿素洗一下。
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2楼2015-03-10 17:39:08
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cs99900810

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-10 17:39:08
1. 挂不上柱就延长一下挂柱时间。
2. 这张图上哪个是你的目的蛋白条带啊？是不是最后一张图的第二条？好歹P个箭头啊。。。你这个蛋白应该是降解的问题，试试把His放到C端试试。
3. 纯化包涵体时，用不同浓度的尿素 ...

1我延长时间了
2最后泳道从上数第一条是目的带，我的HIS在C端
3已用不同浓度尿素洗过
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3楼2015-03-10 17:44:41
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九字江山

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cs99900810 at 2015-03-10 17:44:41
1我延长时间了
2最后泳道从上数第一条是目的带，我的HIS在C端
3已用不同浓度尿素洗过...

全是降解带。。。可能在破菌时就降解了。。。━┳━　━┳━ 做下Western检测下，其实这蛋白挂的还可以。
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4楼2015-03-10 17:49:34
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cs99900810

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-10 17:49:34
全是降解带。。。可能在破菌时就降解了。。。━┳━　━┳━ 做下Western检测下，其实这蛋白挂的还可以。...

western结果一样 一个模子刻出来的 而且两次用的不同裂解方法，western用的bug baster master mix
求助！急包涵体纯化！
western.png
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5楼2015-03-10 17:58:35
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
实在是不行了就试试切胶吧。
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6楼2015-03-11 22:49:16
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yuhan131481

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、感觉蛋白表达量不高 2、蛋白纯化过程中有降解，可以加蛋白酶抑制剂，注意低温。3、挂柱效率低得话，binding buffer中不要加咪唑或者在N端再加一个标签。
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7楼2015-03-12 08:42:42
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lxgnh166

银虫 (正式写手)
★
cs99900810(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-12 20:24:16
纯化包涵体有两种1.变性条件下纯化，如果你的表达没有问题，NI柱的吸附应该是没有什么问题的。2.复性条件下纯化，如果你的复性结果不好，HIS标签被包裹，NI柱是不吸附的。单一一个NI柱效果不好，你可以尝试下离子交换。
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8楼2015-03-12 09:11:29
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lilyshuoxu
9楼2015-03-12 09:47:31
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
10楼2015-03-12 10:57:30
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