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spirit_free

金虫 (小有名气)

[求助] PBI121 与目的片段连接后转入DH5α,长出的菌落提取质粒都是空载,求原因 已有3人参与

我是将PBI121载体与目的片段分别双酶切后电泳,切胶回收,再做连接的。PBI121双酶切是切去GUS基因(约1.8kb),要连接的目的片段是113bp,用连接后的产物转化DH5α,挑取得到的菌落,摇菌提质粒,得到的质粒是含有GUS基因的PBI121,而不是我预期的到的pbi121与目的片段的连接产物。求各位帮忙分析原因。另外求教怎样提高PBI121与目标片段的连接成功率,是不是我的目标片段太小了因此与PBI121连接比较困难。
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风随心动

铜虫 (小有名气)

送红花一朵
你好,请问我可以向你求助点PBI121质粒吗?原谅我如此厚脸皮,因为实验真的需要,谢谢。
偶见繁星梦九天,只愿沧海桑田始如先。
5楼2015-10-20 12:38:30
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2015-02-01 14:56:28
spirit_free: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-02-02 00:11:49
载体酶切不充分,另外,通常100bp小片段回收效率都比较低,回收后电泳检测确保回收到了,关于连接体系可以提高大:小的摩尔浓度比,比如1:3,鉴定重组子先用菌液PCR粗筛,多挑些菌

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2015-01-30 17:23:31
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2015-02-01 14:56:35
spirit_free: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-02-02 00:11:59
构建重组质粒做转化时最好加对照,除了连接产物之外,用你酶切后的载体转化做对照,你酶切后的载体这个板是不是有菌落,如果有可以确定是你酶切的问题,如果没有,你再调整下你的载体和目的基因的比例
医学&统计学
3楼2015-02-01 11:00:29
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还重名啊

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
连接时间加长(16度过夜),提质粒之前先菌P,筛选的时候板抗生素浓度提高点
4楼2015-02-01 23:59:15
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