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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PBI121 与目的片段连接后转入DH5α，长出的菌落提取质粒都是空载，求原因
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spirit_free

金虫 (小有名气)

[求助] PBI121 与目的片段连接后转入DH5α，长出的菌落提取质粒都是空载，求原因 已有3人参与

我是将PBI121载体与目的片段分别双酶切后电泳，切胶回收，再做连接的。PBI121双酶切是切去GUS基因（约1.8kb），要连接的目的片段是113bp，用连接后的产物转化DH5α，挑取得到的菌落，摇菌提质粒，得到的质粒是含有GUS基因的PBI121，而不是我预期的到的pbi121与目的片段的连接产物。求各位帮忙分析原因。另外求教怎样提高PBI121与目标片段的连接成功率，是不是我的目标片段太小了因此与PBI121连接比较困难。
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风随心动

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1楼 2015-01-30 16:28:23
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风随心动

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
你好，请问我可以向你求助点PBI121质粒吗？原谅我如此厚脸皮，因为实验真的需要，谢谢。
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偶见繁星梦九天，只愿沧海桑田始如先。
5楼2015-10-20 12:38:30
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-02-01 14:56:28
spirit_free: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-02-02 00:11:49
载体酶切不充分，另外，通常100bp小片段回收效率都比较低，回收后电泳检测确保回收到了，关于连接体系可以提高大：小的摩尔浓度比，比如1：3，鉴定重组子先用菌液PCR粗筛，多挑些菌

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-01-30 17:23:31
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-02-01 14:56:35
spirit_free: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-02-02 00:11:59
构建重组质粒做转化时最好加对照，除了连接产物之外，用你酶切后的载体转化做对照，你酶切后的载体这个板是不是有菌落，如果有可以确定是你酶切的问题，如果没有，你再调整下你的载体和目的基因的比例
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医学&统计学
3楼2015-02-01 11:00:29
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还重名啊

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接时间加长（16度过夜），提质粒之前先菌P，筛选的时候板抗生素浓度提高点
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4楼2015-02-01 23:59:15
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