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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » cDNA，3.5Kb 扩增不出来
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)

[求助] cDNA，3.5Kb 扩增不出来 已有2人参与

用玉米叶片提取RNA并反转录为CDNA，我需要扩增的片段为3.52Kb,包括5‘UTR区。做PCR一直跑不出来，一条带也没有。引物的退火温度都是66度以上的，跑程序时退火温度设置为55-62度，这区间的都试了还是没有结果，求各位同仁们指导，谢谢！可否按照KOD酶的两步法跑PCR。
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1楼 2015-01-12 21:41:33
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-12 21:52:40
今天遇到两个做玉米的同行了。你这个问题我也曾遇到过。慢慢摸索。建议先换酶，3.5kb可以先试试LA taq。玉米本身基因组结构比较复杂，有很多的转座子，延伸延伸时间，再试试。另外，看看你扩增的片段的GC含量，这个 ...

GC含量30%-40%，不高吧，敢问大师是做玉米哪一方向的

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3楼2015-01-12 23:41:51
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-12 23:00:19
今天遇到两个做玉米的同行了。你这个问题我也曾遇到过。慢慢摸索。建议先换酶，3.5kb可以先试试LA taq。玉米本身基因组结构比较复杂，有很多的转座子，延伸延伸时间，再试试。另外，看看你扩增的片段的GC含量，这个问题曾经困扰过我，后来换用GC buffer解决了这个问题。祝你好运。
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2楼2015-01-12 21:52:40
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-12 21:52:40
今天遇到两个做玉米的同行了。你这个问题我也曾遇到过。慢慢摸索。建议先换酶，3.5kb可以先试试LA taq。玉米本身基因组结构比较复杂，有很多的转座子，延伸延伸时间，再试试。另外，看看你扩增的片段的GC含量，这个 ...

GC含量30%-40%，不高吧，敢问大师是做玉米哪一方向的

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4楼2015-01-12 23:47:45
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没想好名字

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

其实多次实验发现，你首先用Tm-3试一下，如果什么都没有，可以用两步法Tm-2x5+Tm-10x30来试试，如果都没有，直接换引物，如果有东西，可进一步优化条件。
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5楼2015-05-08 15:55:40
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