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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 连接转化相关，求大神指教
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清水淡茶

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化相关，求大神指教 已有4人参与

最近在做一个载体构建，一直做不出来：目的基因和载体用了一个同尾酶（目的基因BgⅡ、载体BamHⅠ）另外一个是SpeⅠ,目的基因PCR出来后载体和目的基因分别双酶切，用的是NEB酶，酶切时间是两个小时，然后用体积1:4的比例连接1h涂板后没有长菌。之后又用同样的比例再连接，同时做一个比例为2:3的连接。第二天后者长了十几株菌，前者没有长菌。检菌没有检出阳性菌，但是我还是拿去测序了，测序后结果不对；同时还拿了个连接T载的质粒去测序，测序结果是对的。
表达可能不是很清晰，希望大神给我分析一下，非常感谢!!

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1楼 2015-01-11 22:34:17
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒测序的质粒从何而来？先确定你目的基因是否正确，连接时间可以适当延长。个人认为一个小时稍短。

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2楼2015-01-11 22:51:20
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崔晶晶890507

新虫 (小有名气)
我们一般连接过夜，酶切时间3小时左右，不过酶切时间你可以自己摸一下，酶切后跑胶看一下有没有没切开或切烂的情况，再适当地延长或缩短酶切时间
一般连不上也就着两个问题了吧
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3楼2015-01-20 10:45:24
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 崔晶晶890507 at 2015-01-20 10:45:24
我们一般连接过夜，酶切时间3小时左右，不过酶切时间你可以自己摸一下，酶切后跑胶看一下有没有没切开或切烂的情况，再适当地延长或缩短酶切时间
一般连不上也就着两个问题了吧

主要是因为连接和酶切吗？

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4楼2016-05-25 17:52:57
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

长出来的菌落测序不对是什么意思？是空载呢？还是压根不知道是什么序列呢

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
5楼2016-05-25 22:04:21
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221345

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

连接时间有点短，而且你连接时温度多少？酶切后的片段有跑胶看过吗？菌落有可能是空载体，确定没污染吧？
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6楼2016-05-31 23:27:48
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雨儿天0320

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你使用的连接转化的试剂是试剂盒吗?如果是购买的现成的连接试剂的话，一般会有一个本身载体的正对照，你操作时，同时做正对照来检验你的操作手法是否正确
如果你的目的片段较大的话，连接之间需要相应延长，然后转化之后涂板时也要涂布均匀，怎么也得过夜培养吧！
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7楼2016-06-01 14:18:17
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hanysimida

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 崔晶晶890507 at 2015-01-20 10:45:24
我们一般连接过夜，酶切时间3小时左右，不过酶切时间你可以自己摸一下，酶切后跑胶看一下有没有没切开或切烂的情况，再适当地延长或缩短酶切时间
一般连不上也就着两个问题了吧

如果连接时间短，那应该还是有空载体的，1：4那个应该也能长出来是不是

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8楼2017-01-04 09:54:31
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