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自己设计的引物添加了酶切位点之后总是P不出来条带来已有1人参与
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先把自己的序列与设计的引物放上来： TATCGAGAATGCACCAATGACCGCAATACATGACCGAGTACTAGCTTCTGGTCAATAAGGCATGTGTTAAACAGGGAAAAGAAACACATACTTCCATTCTGAATCACGGGGAGCATCACTTTCTAAAAACTCACTTGGAGCTTCACTGGGTGCTAGTTTTGAGCTTGGAAATACTGGTGATTTGGACGGCCCAGCGTTGCCCCTCGTTACATCACTACTTAAACCTATCTGTTGAGACATTGTAGAAGAGAAGGAACAAATGTACAACCAGATCGTGAACGGATGTCTTGTACGAAGATATTGCGGTAGTATGGAATTGATGCTCTCTACTCACTTGGATATCGAACTTACTTATAGTTGAATAGTCCACGAAGGATGGAGCCCTGAAGAATCATGTCTGATCAAGATAGATCGGAGGTTCCATGGCTTTTGGAATTGAAGCAACGCCACTCACGATATGTACGGTAGATTGTTAGGACAGATTATTGTTAAACCATCTAGAGAATCTTTCTCCTTAGATGTACGATTGGTACGGTGGGCAGGATTGTCATTTGTATTGCGGCACATCTTGATCGTTCCAATCACCACTGAAGTCGACAAAACCCTTGTTGTTTTATCGTTAGGAGATCAAAGACCACTGGTGGACCTTCTATTTTGGTTTTCTGGGGATTTTGTCAATAAGCTCGTTGTCGTTCGGGGTAAATTATGTAAGATGTGAGTAATAAAGTGGGCCGGACTGCCCGAGAATCCACGGACATTGAGGTCTTCACCATGGACAGACTCGAACTAGTATTTTCATATCATCATCATGTACGACAACTCCTTTCATTCTTCACGTACTCGCAATATCATCTTCAATTAATACACTTAACCTTCGGAGATTATTATTCGTGAAAGTTTTAGTCCATTTGCATCGAATCGGCATGAAGCGATCCCCGCCAATCGATTTGTCTCAGGACGGGCGTAAGGAGAAAATAGCTCGTCGACAGGACCCTGTCTCATGCCAGTTTTGTCGGGCCAAGAAACTCAAGGTAAGAATGCCACTCTAAGAAAGATAACGAATCGCTTCTGACTTCAATAGTGTGATCGCAATTTTCCATGCAGTAATTGCAGAGCTCGCAGACTTCCTTGCGTGTCAGCTGCAGGTCAAGCAGACACTCCAGGTTCCCAGCCGATTAATTCTGTCTCGGCAGGATCGTCAAGGTCAGTGCTGCGGCTTCAATGAGTTTTGCTAGCTTTGTCTCATTATTACTATAATAGTCAAGGGATTGAGGAGTTAAACGCCCGTCTGAGAAGGTTAGAGGAACTTCTAGAAAAAAACATCAATGTATCTAGAAGTTCGAGAGATACCGCATCTGGTATTGCTTTTTCCTTGCAACCCTTCTTGTATCAAATCCTGGCTGACAAAAGGCTAGTCGCCTCGACGCAAGAAACGCCTGCAGAAGATGCCCAAATTACAAATACAGTCTCGTGGTTAGAATCTGATGCTTTCGAGCACCGAAACCTCCAAGAGTCCACAAATTATGTAATTCTATTTCCCTAAAACTTAGCTTCGAAGCGCTAATCAAATAGAATCTTCTATGTTACAATGATGAAATCACACAAACTTTTGCTGCTTCCTTTTTAGGTACGTCGGCTACTACTGTACGAACAGGTGTCGACGCTCAAAGTTTGGCTTCACTTCCGTCTAGAAAGCATGCA 下游序列：，正向引物：5’—3’(SacII)AAACCGCGG（酶切位点）TCGTGAACGGATGTCTTG 反向引物5’—3’(KpnI)AAAGGTACC（酶切位点）GGACTCTTGGAGGTTTCG，自己设计的引物，构建载体时作为下游片段用的，正向的引物TM为66.6度。下游为63度。现在P出来的条带完全是弥散的。试过各种方法了，从换体系，梯度PCR到taq酶，所以想换引物了。求大虾帮助设计一下引物，酶切位点还是这两个。不胜感激。 |
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