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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 目的基因和表达载体连接不上，求指导！！！
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因和表达载体连接不上，求指导！！！ 已有3人参与

我的目的基因2.2k，送去公司直接合成的。合成后的目的基因连接在puc57载体上，质粒大小为4.9k，其中目的基因2.2k，puc57载体本身2.7k。以质粒为模板进行pcr，胶回收目的片段，然后双酶切（bamh1和ecor1）目的片段和表达载体pyes2（5.9k），连接，转化。平板顺利长菌了，菌落pcr结果为阳性，提质粒酶切以后，却惊奇的发现两条带的大小约为2.2k和2.7k！！！！质粒竟然是最初的“目的基因+puc57载体”，而不是自己想要的“目的基因+pyes2载体”！！！全是假阳性，没有我想要构建的质粒，why？！！！
       我明明已经切胶回收了，按说不应该污染这么多当时pcr做模板的质粒啊，新手上路，求大家指导！
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1楼 2014-12-08 13:07:00
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去哪里看海

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看你的表述应该是没有问题的，既然现在出问题了，就一项一项的排除。如果都这么做下来的话，出现了puc57质粒就不应该，因为根本就没有他的事，P完目的条带就用不上了啊。
首先，合成的片段有没有问题，跟NCBI对比一下；PCR获得的目的片段大小正确？回收做的有无问题？酶切一定切好了吗？？质粒的酶切有两条带是不是？
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2楼2014-12-08 14:48:56
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 去哪里看海 at 2014-12-08 14:48:56
看你的表述应该是没有问题的，既然现在出问题了，就一项一项的排除。如果都这么做下来的话，出现了puc57质粒就不应该，因为根本就没有他的事，P完目的条带就用不上了啊。
首先，合成的片段有没有问题，跟NCBI对比一 ...

我在想是不是连接体系有问题？尝试一下把连接体系里面的基因片段少加一些试试。真心想不到哪里还有问题
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3楼2014-12-08 15:31:46
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去哪里看海

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by HSY郡主 at 2014-12-08 15:31:46
我在想是不是连接体系有问题？尝试一下把连接体系里面的基因片段少加一些试试。真心想不到哪里还有问题...

还是觉得不应该有Puc57质粒，所以啊，你的酶切结果也有可能不是他们俩，就是凑巧，看看这两个酶切位点是不是只有一个
如果觉得链接体系有问题的话，可以多做几种，用不同的比例，1:4 2:3 都可以试试
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4楼2014-12-08 17:23:54
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 去哪里看海 at 2014-12-08 17:23:54
还是觉得不应该有Puc57质粒，所以啊，你的酶切结果也有可能不是他们俩，就是凑巧，看看这两个酶切位点是不是只有一个
如果觉得链接体系有问题的话，可以多做几种，用不同的比例，1:4 2:3 都可以试试...

请教了一下师兄，找到问题所在了。是pcr产物里面污染了质粒，我这次提的Puc57质粒，有好几条带（6-7条），其中最下面的淡淡的那条带跟pcr产物带几乎在一个位置。赤裸裸的污染啊！！！也就是说我的目的片段跟pyes2根本没连上，改变一下连接体系再试试吧，不知道能不能做出来
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5楼2014-12-08 19:02:09
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fengliar

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
6楼2014-12-09 08:23:10
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fengliar at 2014-12-09 08:23:10
楼主是不是双酶切后，没有电泳做胶回收呢？若想省去这步，可以用目的片段的引物进行PCR，并确定目的片段后是否有终止子。

双酶切以后做了胶回收，当时也是污染了puc57的质粒。后来就开始拿引物直接p的，然后胶回收的，可是还是污染了puc57的质粒。
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7楼2014-12-09 09:24:21
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去哪里看海

铁虫 (小有名气)
★ ★
HSY郡主(dllchina代发): 金币+2, 鼓励热心应助 2014-12-12 15:08:05
引用回帖:
5楼: Originally posted by HSY郡主 at 2014-12-08 19:02:09
请教了一下师兄，找到问题所在了。是pcr产物里面污染了质粒，我这次提的Puc57质粒，有好几条带（6-7条），其中最下面的淡淡的那条带跟pcr产物带几乎在一个位置。赤裸裸的污染啊！！！也就是说我的目的片段跟pyes2根 ...

弄明白了就好。
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8楼2014-12-09 11:19:18
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wanglei512

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用重叠pcr，扩目的基因的上下游引物两段含有pyes2载体（bamh1和ecor1之间），扩pyes2载体的上下游引物含有目的基因的两段。回收两个片段，再PCR扩增，形成多聚体后，直接转化。
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9楼2014-12-10 15:51:29
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wanglei512 at 2014-12-10 15:51:29
用重叠pcr，扩目的基因的上下游引物两段含有pyes2载体（bamh1和ecor1之间），扩pyes2载体的上下游引物含有目的基因的两段。回收两个片段，再PCR扩增，形成多聚体后，直接转化。

不太明白怎么回事。。。形成的多聚体是线性的吧？转化进去以后可以自己形成想要构建的载体吗？
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10楼2014-12-11 13:21:58
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