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求银染详细操作步骤 已有1人参与
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| 想拿银染之后差异表达的蛋白做质谱，求详细的银染操作步骤？试剂配方？以及后续脱色液配方和方法？另外银染跑的胶是否为一般的变性聚丙烯酰胺凝胶。 |
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董博士
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【答案】应助回帖
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乖宝文文(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-11-29 20:56:49
乖宝文文: 金币+15, ★★★很有帮助 2014-12-03 09:08:34
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我之前也做过银染，用的是康威的试剂盒，不过中间有一些试剂是要自己配制的，还有一些过程的反应时间可能也是需要进行修改和完善的，我跟你说一下我的步骤吧： 1. 电泳完成后，用超纯水洗胶2次，每次洗涤5分钟。 2. 固定：将凝胶浸泡在 25 ml 的固定液中，固定液充分覆盖胶。放于摇床上室温摇动 15 分钟。更换固定液，重复一次。固定液的配制：超纯水：乙醇：冰醋酸=6:3:1. 3. 固定完成后，配制 10%乙醇，洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。 4. 再用超纯水洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。 5. 配制银染增敏工作液：取 50 ul Silver Stain Sensitizer（500×）加入到 25 ml 超纯水中，混匀。 6. 将步骤 4 洗好的凝胶置于银染增敏工作液中，室温下准确孵育 1 分钟（这里时间可以适当延长的），之后用超纯水洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒。 7. 弃去超纯水，将凝胶置于 Silver Stain 中孵育 30 分钟 （我做的时候是孵育45min-1h）。 8. 配制终止液：5%冰醋酸。 9. 用超纯水快速洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒（时间不用很准确）。 10. 立即将洗好的凝胶浸没在 Silver Stain Developer 中，室温孵育 2-3 分钟，直至蛋白条带显示清晰（我做的时候室温孵育时间比较长，因为我也是为了找到差异条带打质谱的，10分钟甚至更长都是可以的，建议最好一直在旁边看着，直至出现满意的结果）。 11. 用终止液洗去凝胶上的 Silver Stain Developer 后，将凝胶浸泡在新的终止液中反应 10 分钟。 (注：孵育是摇床速度调到最小，洗涤时速度要加快，和western洗膜的速度一样就行) 用一般的SDS-PAGE胶就可以 |
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