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小T在努力！

木虫 (小有名气)

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[求助] 急求农杆菌Gv3101 感受态制备方法。已有4人参与

如题，步骤最好详细点，第一次做完全没经验。如果觉得金币不够再加好吗？急求！

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加油哦！

1楼 2014-11-22 12:06:56

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骑着企鹅漂移

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小T在努力！(myprayer代发): 金币+3, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-23 12:36:14
小T在努力！: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-11-23 15:41:53

实验试剂
利福平，LB培养基，NaCl，CaCl2，YEP培养基，卡那霉素
实验设备
摇床，高速离心机，低温冰箱，水浴锅
实验材料
根癌农杆菌GV3101单菌落
实验步骤
1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备
   1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；
   2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；
   3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；
   4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；
   5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；
   6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。
2. 冻融法转化农杆菌
   1) 冰浴融化农杆菌LBA4404/GV3101感受态细胞；
   2) 加入3ul表达载体质粒，冰浴30min，液氮中冻1 min，然后在37℃水浴5min；
   3) 加入950uL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h；
   4) 1 0000rpm离心1 min以浓缩菌液，用100uL YEP回溶菌体；
   5) 将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃培养36-48h。菌液PCR检测阳性克隆

[ 发自小木虫客户端 ]