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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急求农杆菌Gv3101 感受态制备方法。
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小T在努力！

木虫 (小有名气)

[求助] 急求农杆菌Gv3101 感受态制备方法。 已有4人参与

如题，步骤最好详细点，第一次做完全没经验。如果觉得金币不够再加好吗？急求！
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加油哦！
1楼 2014-11-22 12:06:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-23 12:35:57
小T在努力！: 金币+1, ★有帮助 2014-11-23 15:42:26
留个QQ聊，这个并不难，愿交流

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2楼2014-11-22 12:08:22
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chiden

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小T在努力！(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:17:54
引用回帖:
13楼: Originally posted by 小T在努力！ at 2014-11-25 12:20:26
怎么洗(⊙_⊙)……
...

就是离心重悬撒，但是一定要注意必须在低温下操作，就是冰水混合状态，然后不要用枪头反复吹打，如果一定要用的话，就把枪头减掉一部分，温柔的重悬。然后分装就可以啦。。
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即使难过，也要微笑着走下去
14楼2014-11-25 19:01:12
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普通回帖

小T在努力！

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-11-22 12:08:22
留个QQ聊，这个并不难，愿交流

748681533谢谢

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3楼2014-11-22 12:53:32
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小T在努力！

木虫 (小有名气)
大神快出来指教一下吧！好吗？用氯化钙制备感受态。

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4楼2014-11-22 21:05:36
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lcb930726

木虫 (著名写手)
就没题目
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5楼2014-11-22 21:30:46
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conanyangqun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-23 12:36:05
小T在努力！: 金币+1, ★有帮助 2014-11-23 15:42:09
论坛里就有这样的方法。站内搜索一下吧

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6楼2014-11-23 00:30:19
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骑着企鹅漂移

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小T在努力！(myprayer代发): 金币+3, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-23 12:36:14
小T在努力！: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-11-23 15:41:53
实验试剂
利福平，LB培养基，NaCl，CaCl2，YEP培养基，卡那霉素
实验设备
摇床，高速离心机，低温冰箱，水浴锅
实验材料
根癌农杆菌GV3101单菌落
实验步骤
1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备
   1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；
   2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；
   3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；
   4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；
   5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；
   6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。
2. 冻融法转化农杆菌
   1) 冰浴融化农杆菌LBA4404/GV3101感受态细胞；
   2) 加入3ul表达载体质粒，冰浴30min，液氮中冻1 min，然后在37℃水浴5min；
   3) 加入950uL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h；
   4) 1 0000rpm离心1 min以浓缩菌液，用100uL YEP回溶菌体；
   5) 将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃培养36-48h。菌液PCR检测阳性克隆

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7楼2014-11-23 07:27:59
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小T在努力！

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lcb930726 at 2014-11-22 21:30:46
就没题目

什么意思。。。

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加油哦！
8楼2014-11-23 13:11:20
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小T在努力！

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 骑着企鹅漂移 at 2014-11-23 07:27:59
实验试剂
利福平，LB培养基，NaCl，CaCl2，YEP培养基，卡那霉素
实验设备
摇床，高速离心机，低温冰箱，水浴锅
实验材料
根癌农杆菌GV3101单菌落
实验步骤
1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备
  ...

请问这是你做的还是查的资料？我们的3101是双抗，利福平和庆大，摇菌的时候也是加两种抗生素，总是摇不出来。。。难道只加利福平就可以？
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9楼2014-11-23 15:40:45
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chiden

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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小T在努力！(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:05:16
引用回帖:
9楼: Originally posted by 小T在努力！ at 2014-11-23 15:40:45
请问这是你做的还是查的资料？我们的3101是双抗，利福平和庆大，摇菌的时候也是加两种抗生素，总是摇不出来。。。难道只加利福平就可以？...

很多时候用利福平就够了，教你个更简单的方法，用10% 的甘油低温状态下洗三次，分装就可以了。
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即使难过，也要微笑着走下去
10楼2014-11-23 22:28:41
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