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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 用DNase除RNA里的DNA，可是RNA也会降解，求解答。
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romantic昊

新虫 (初入文坛)

[求助] 用DNase除RNA里的DNA，可是RNA也会降解，求解答。 已有3人参与

我一般用OMEGA的试剂盒提取棉花子叶的RNA，严格按照它的流程操作，可是依旧有DNA污染。然后用全式金的DNase,buffer,没有rna酶的dd水去除DNA，在除之前测了rna浓度是567ng,可是除完以后就剩下68ng。我是想要做PT-PCR的，现在停在了这一步。只要除DNA，RNA的损耗也很大，要想逆转录成功的话，rna的浓度不得到100以上吗？跪求高手给个解答啊，我把流程贴一下：一、DNase处理残留RNA
处理体系的建立：
         45微升：总RNA20微升，buffer4.5微升，DNase4.0微升，没有RNA酶的dd水补齐。然后37°抽提1个小时，
二、处理后DNA的纯化
1.        首先加入200ul的DEPC 处理水（增加抽提的体积，以减少抽提过程中RNA的损失量）。
2.        加等体积的氯仿，充分颠倒混匀，12500g, 离心5min，吸取上清至另一新的1.5ml的离心管中。
3.        加2倍体积的异丙醇，冰上20min(也可-20℃，20min)。
4.        13000g, 离心5min，小心弃上清，加400ul的无水乙醇，颠倒混匀。
5.        13000g, 离心5min，小心弃上清，再瞬时离心，吸去残留的无水乙醇，RNA沉淀至通风橱中干燥。
6.        加适当体积的DEPC 处理水溶解沉淀（按照上面体积，则可加13ul的DEPC 处理水）。   
注：步骤1是优化后自行加入的，因为这样扩大了抽提的总体积，在离心后吸取上清液时较容易，并且减少了RNA的损失量。
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1楼 2014-11-15 12:40:12
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romantic昊

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zshw_001 at 2014-11-15 15:08:17
DNase和buffer的量适当少一些试一试吧。

恩，那我试试吧
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5楼2014-11-15 19:07:45
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
romantic昊(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-16 22:24:06
RNA酶没除净你就上DNA酶，跑个胶不就明白怎么回事了

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-11-15 13:16:37
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
romantic昊(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-16 22:24:18
dna酶也有部分降解rna的活性

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-11-15 14:48:07
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
romantic昊(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-16 22:24:28
DNase和buffer的量适当少一些试一试吧。
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永远相信未知的总是美好的！
4楼2014-11-15 15:08:17
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