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three姚

银虫 (小有名气)

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[求助] DGGE银染，泳道颜色为什么这么深？已有3人参与

如下图，我这批样品的PCR条带不是特别亮，所以DGGE效果也不好，只能隐约看到一些很浅的条带，但是不知道为什么泳道的颜色特别深，尤其是顶部和底部颜色很深，还有之前一次做的条带很清晰，但是泳道颜色也很深，想请教一下是什么原因？我用的引物是f338-GC/r518，胶的浓度是8%，变性梯度40~65%，染色方法是银染法。具体染色过程是：
1.取下胶板后，放在塑料盘里，用去离子水把胶从玻璃板上洗下来，再多清洗一次（每次清洗1~2min）
2. 加250ml固定液（10%冰醋酸溶液）固定15min
3. 倒掉固定液，去离子水洗两次（每次1~2min）
4. 加250ml印染液（0.2%硝酸银溶液，用之前加200μL甲醛），轻轻摇动，染色15min
5. 倒掉印染液，去离子水洗两次（每次1~2min）
6. 加250ml显色液（1.5% NaOH溶液，用之前加1.25ml甲醛），轻轻摇动，直到条带清晰为止（15~20min）
（所有溶液都没有重复利用，都是从事先配好的溶液里取的）

因为实验比较急，希望大家能提供一些合理的建议和可行的方法，多谢了！

这一次的结果

之前一次的结果，条带很清晰，但是泳道颜色还是很深

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思念是一棵没有年轮的树，永不老去

1楼 2014-11-13 15:54:17

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three姚

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引用回帖:

2楼: Originally posted by Rubisco580 at 2014-11-14 10:57:40
看你用的是强碱NaOH，要不试试碳酸钠显色？浓度嘛，我染蛋白是2.5%，不知道你这个应该多大浓度，可以试试。
还有，硝酸银溶液那步要避光摇动，不然背景深。
显色久了背景也会很深。
希望对你有帮助。

谢谢回复，弱碱法我确实没试过，可以试一下。您说显色久了背景会深，但是我这在条带出现之前泳道就显色了，等条带清晰了泳道就变得这么深了，所以可能主要不是时间的问题。。。不过染色那步我都没有避光，这一点您提醒了我，改天要试一下。多谢了！