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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » DH5α转化后 提取质粒提取不出来
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永峰1230

铜虫 (小有名气)

[求助] DH5α转化后 提取质粒提取不出来 已有9人参与

将pet28α连接目的基因后，转化到DH5α 感受态，，  转化涂布，阴阳性对照都正常，，涂布的板子上至长出了一个菌落，，养菌后，提取质粒，提取不出来，是什么原因呢？    ----  养菌过程中都加了Kana的，浓度是50
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12
1楼 2014-10-19 19:48:17
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
22楼: Originally posted by 灰血动物 at 2014-10-28 09:56:34
挠头中。。。。。

问问实验细节吧 转化体系，电击时间等等。。。。这个体系基本上随便转化都会得到很多克隆的

另外，离心去上清后，需要加入少量的LB或者水将“沉淀”重悬，再涂布 你也可以选择不同的体积涂 ...

转化体系： 载体7 ul, 基因 1 ul, T4 1 ul , T4 buffer 1 ul ，  22℃  2小时，

热激转化 （42℃  90S ），        离心去上清后，，没有把上清去除完全，留有大约100 ul ， 重悬后，全部涂布，，   kana 浓度 50ug/ml 。   平板 之前都是存放了将近半个月，，最近都是在一周内使用，，
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12
23楼2014-10-28 14:50:00
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593318518

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-19 23:26:02
永峰1230: 金币+3, ★有帮助 2014-10-20 17:55:49
pET应该不是高拷贝质粒吧，不知道楼主提没提出来是怎么判断的。
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2楼2014-10-19 21:00:30
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s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-19 23:22:58
永峰1230: 金币+4, ★有帮助 2014-10-20 17:55:40
经常有因为小提的kit或者试剂问题提不出质粒的，问问实验室其他最近有提质粒的人kit是不是OK，另外可以做一下菌落PCR，确认楼主的目的片段在细菌里。
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There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
3楼2014-10-19 21:48:31
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 593318518 at 2014-10-19 21:00:30
pET应该不是高拷贝质粒吧，不知道楼主提没提出来是怎么判断的。

在DH5α里 能够拷贝很多的吧，， 试剂盒提取的时候 在加入buffer III 的时候 和正常情况下 相差很大， 跑电泳也没有跑出来
、
其他重组菌用这个 试剂盒 是可以提取出来的
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12
4楼2014-10-20 10:26:13
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