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sadhappy新虫 (正式写手)
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[交流]
qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？ 已有6人参与
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说明书如下，cDNA要加100ng，那么体积怎么算？ 如果反转录加的RNA总量是1μg,20μl体系。最后反转录的CDNA有多少？ 我看有的人说就加1μl,好像是稀释后加的，那么稀释的标准是什么啊？如何稀释 ![\"qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？\"](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/1018/w316h722882_1413591408_842.jpg#opennewwindow\") |
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13楼2018-03-16 10:33:53
2楼2014-10-18 10:38:26
刘芬玲
金虫 (初入文坛)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 1274.3
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- 帖子: 45
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- 注册: 2014-03-20
- 性别: MM
- 专业: 炎症、感染与免疫
3楼2014-10-18 11:43:56
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-20 08:47:08
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-20 08:47:08
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我不知道你用什么反转录体系。我看不到你的说明书。 我的理解是，反转录并不扩增。所以，通常我都是准备2000ng的RNA做反转录。RT之后，cDNA就当是2000ng。20ul的体系，1ul就是100ng。 楼上朋友们说反转录之后测cDNA浓度，似不妥。因为反转录体系里成分已经很复杂，有dNTP，酶，缓冲液，模板，RNA酶抑制剂，随机引物。这么复杂的成分，会影响浓度的测量。 至于最后用多少cDNA做PCR，这个要看你的实验目的是什么，目标基因的丰度，使用何种设备，何种PCR体系，等等。 我做过组织和细胞样品的mRNA水平检测，用Applied Biosystems 9600， Sybr Green。大部分的样品cDNA（如上制备）需要稀释100倍做qPCR，供你参考。 如果你以前没做过qRT－PCR（看起来是这样哈：），估计需要摸索一段时间才可能得到比较可信的数据。这个东西，说简单就简单，照说明书做，不很复杂；但要想做得好，得到可信、稳定的数据，有很多细节。真正做好还是要花点功夫的。祝你好运。 |
4楼2014-10-18 14:14:06