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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 连接转化
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青青草allan

银虫 (小有名气)

[求助] 连接转化 已有7人参与

扩出的基因片段2000bp左右，切胶回收的产物经电泳检测了，条带清晰。连接转化，挑斑摇菌后，用M13引物和自己的引物检测菌液，都检测不出来，求大神指点啊！这种菌液有必要送公司测序吗？
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爱出者爱返，福往者福来
1楼 2014-10-13 12:09:28
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-13 15:55:54
青青草allan: 金币+2, ★有帮助 2014-10-14 22:27:23
青青草allan: 金币+2, ★有帮助 2014-10-14 22:34:57
做PCR时加阳性对照、阴性对照了吗？
如果菌液PCR结果都是阴性，建议不要送测序。
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2楼2014-10-13 12:14:23
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cjl25413477

木虫 (正式写手)

欧巴

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-13 15:55:59
青青草allan: 金币+2, ★有帮助 2014-10-14 22:31:24
请问下你是直接用菌液做的模板么？如果是这样的话有两种可能导致你的pcr失败：1、如果你的菌液的OD不够的话，会导致你的模板数量不够；2、如果使用菌液直接做的模板：培养基的成分很复杂，会影响到你的扩增体系，从而导致你的pcr失败。
如果你是把你的菌液离心然后用超纯水洗过两遍以上的菌体作为模板，并且没有做阴性和阳性对照，我想有两种结果：1、是你pcr体系没有做好！2、是你根本没有转化成功！

建议：还是等结果确定后再送测序吧！
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路漫漫兮，吾必上下而求索！
3楼2014-10-13 15:29:33
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
青青草allan: 金币+2 2014-10-14 22:31:48
多挑几个斑试试，如果30多个，还没有，那就重新做一次吧
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4楼2014-10-13 16:06:28
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
青青草allan(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-14 10:56:23
青青草allan: 金币+2, ★有帮助 2014-10-14 22:33:09
你的问题太简单化了，没办法直接判定你那里有问题。
菌落鉴定都检测不出来，做下阴性对照看看。
还有就是连接的时间要长，片段比较大。
赞一下 回复此楼
学习再学习，努力再努力。
5楼2014-10-13 16:16:47
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反应链

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
青青草allan(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-14 10:56:46
青青草allan: 金币+2, ★有帮助 2014-10-14 22:33:49
青青草allan: 金币+2 2014-10-14 22:34:33
质粒验证，还是要靠酶切。

TA克隆的话，两组酶切：

（1）HindIII单酶切；
（2）salI、EcoRI双酶切。

阳性克隆：（1）约5Kb；（2）约3kb，跑长时间，胶浓度大些，载体与片段条带也可区分。
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6楼2014-10-13 23:18:49
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-10-13 12:14:23
做PCR时加阳性对照、阴性对照了吗？
如果菌液PCR结果都是阴性，建议不要送测序。

没有做对照。因为之前短片段菌液检测时也没做过对照，很容易就出来了
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爱出者爱返，福往者福来
7楼2014-10-14 22:28:42
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cjl25413477 at 2014-10-13 15:29:33
请问下你是直接用菌液做的模板么？如果是这样的话有两种可能导致你的pcr失败：1、如果你的菌液的OD不够的话，会导致你的模板数量不够；2、如果使用菌液直接做的模板：培养基的成分很复杂，会影响到你的扩增体系，从 ...

直接用1.5微升菌液做的模板，因为之前做1000以内的片段都是这样检测了，都没有问题啊。嗯，你分析的原因很有道理，谢谢了
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爱出者爱返，福往者福来
8楼2014-10-14 22:31:07
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by happydove at 2014-10-13 16:06:28
多挑几个斑试试，如果30多个，还没有，那就重新做一次吧

好的，谢谢！
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爱出者爱返，福往者福来
9楼2014-10-14 22:31:42
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-13 16:16:47
你的问题太简单化了，没办法直接判定你那里有问题。
菌落鉴定都检测不出来，做下阴性对照看看。
还有就是连接的时间要长，片段比较大。

晚上九点连上的，第二天上午十点多做的转化，时间不算短吧？
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爱出者爱返，福往者福来
10楼2014-10-14 22:33:00
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