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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RNA电泳图 ， 大家帮忙分析下 ， 问题出在哪里 ？
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Devil_Jimmy

银虫 (小有名气)

[求助] RNA电泳图 ， 大家帮忙分析下 ， 问题出在哪里 ？已有4人参与

昨天提取的RNA ，完了跑了个电泳，结果不咋地，今天又重新跑了一次，结果跟昨天不一样了，希望跑过的达人们帮忙分析下，是什么原因导致这样的结果？
Trizol法提取RNA，用的枪头是买的RNase free的，而且经过高压灭菌的。电泳用的设备也用DEPC水清洗过了。
RNA用DEPC水20ul溶解后，取2ul加4ul的5×loading buffer  120V  20分钟左右。
接下来要合成cDNA第一链，完了做Real Time PCR  这样的RNA能不能继续进行下面的实验？

RNA电泳图 ， 大家帮忙分析下 ， 问题出在哪里 ？
今天的.jpg


RNA电泳图 ， 大家帮忙分析下 ， 问题出在哪里 ？-1
昨天下午的.jpg
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神外
1楼2014-10-06 15:11:40
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就会提核酸

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Devil_Jimmy(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-10-06 18:59:55
Devil_Jimmy: 金币+20, ★★★很有帮助 2014-10-06 22:32:29
不知是该抨击这家的 “TRIzol”，还是该批评你的操作手法，导致最后的 RNA 有如此多的 DNA 残留。
无法回答这样的 RNA 是否可以做你最关心的后续实验，因为即使你的引物设计使你不怕 DNA 残留，纯度怎样，以及其它的可能影响后续实验的问题，都只有你自己知道。
就 TRIzol 抽提 RNA 的操作，如果出现了过量的 DNA 残留，一定同时会导致其它东西 - 包括蛋白，苯酚，盐 - 的残留增加。
我的建议是：你首先要解决如何降低 DNA 残留问题，即使单纯的 DNA 残留对你的后续实验没有影响。当 DNA 残留降低到几乎看不见时，讨论其它问题才更有意义。
至于为什么第二天电泳，RNA 反而显得更漂亮，我的解释是：用非变性电泳方式电泳 RNA，RNA 的表现就像猫，你无法掌控。只要在 RNA 该出现的大概位置出现了荧光，或者更直接的讲，只要在溴酚蓝前面没有出现非常非常巨大的荧光，RNA 即使有降解，也不严重。
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3楼2014-10-06 18:17:34
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Devil_Jimmy(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-06 18:58:25
Devil_Jimmy: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-10-06 22:29:10
不能荧光定量吧，从胶上看DNA、蛋白质或多糖等污染相当严重。楼主是不是在氯仿抽提那一步吸取上清的时候太贪多了，这一步不要贪多，宁缺毋滥（或者是用氯仿抽屉两次也可以，第二遍时上清与氯仿等体积）。还有楼主最后溶解RNA的时候是不是有很多不溶物质？如果是，应该是多糖污染严重。
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2楼2014-10-06 17:48:19
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LI斯

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 就会提核酸 at 2014-10-06 18:17:34
不知是该抨击这家的 “TRIzol”，还是该批评你的操作手法，导致最后的 RNA 有如此多的 DNA 残留。
无法回答这样的 RNA 是否可以做你最关心的后续实验，因为即使你的引物设计使你不怕 DNA 残留，纯度怎样，以及其它 ...

有五条带是因为同时有DNA和蛋白质是吗？？如果把DNA和蛋白质都除掉了这个能不能做荧光定量我是超级新手
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呵呵
4楼2014-10-06 21:04:05
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biot

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-06 22:37:43
RNA的纯度很低，不适合做定量。建议重提，让条带清晰，没有污染，操作要注意啊！同意楼上的详细解释

[ 发自小木虫客户端 ]
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扬帆起航！
5楼2014-10-06 22:11:30
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