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95846713

新虫 (初入文坛)

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[求助] PMD18-T 双酶切多克隆位点问题已有1人参与

本人新手，想问问目的基因连接已经设计好酶切位点的引物后，打算双酶切引物设计的酶切位点是 Ecor i和Bamh i 但是我发现连接的 PMD18-T多克隆位点上也有这两个酶切位点，那么我双酶切时怎么才能知道切下来的是多克隆位点的Ecor i和Bamh i 还是目的片段上的Ecor i和Bamh i ？怎样才能确保双酶切时切下来的是目的片段上的Ecor i和Bamh i 呢？

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1楼 2014-09-19 10:04:25

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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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95846713(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-09-19 16:34:12
95846713: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-09-21 16:30:56

1.选择目的片段上的一个酶切位点（非Ecor i和Bamh i ）和一个载体上的酶切位点（非Ecor i和Bamh i ）进行酶切，如果切的开，而且片段大小与预期一致，就可以。这是最好的。
2.PMD18-T上的Ecor i和Bamh i 之间大约是530bp左右。如果你的目的基因与这个相差很大，那么就可以直接用Ecor i和Bamh i 双酶切，看看目的片段的大小；如果相差不大，就用第1种。这种方法只限于快速检测，有一定的不靠谱性。
3.如果你的目的基因与这个相差很大，也可以单酶切看线性片段。这时重组质粒要比载体（2700bp）大。

做克隆最终需要多种酶进行酶切鉴定的。当然了，如果测序就不用做多种了，一两种确定了就测吧，一般不会有大问题。

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